质粒DNA制备基本原理及方法

xiaoqin

    质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。

    在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。在分子生物学中，质粒DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。

    在质粒DNA的应用过程中，其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响，因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。

    在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:

    第一步，培养细菌，使质粒扩增;

    第二步，进行细菌的收集和裂解;

    第三步，质粒DNA的分离和纯化。

    在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比例关系，越小越容易进行提取，这主要是由于，如果质粒DNA比较大的话，其特性机会和染色体DNA比较接近，这样想要将二者分离开来难度就会变大。

    在进行质粒DNA的分离时，适宜的条件是非常重要的，主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等，在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA才能够更好的分离开来。

    细菌浓度对于质粒DNA的提取也是非常重要的，如果细菌的浓度比较高，那么在溶菌时，溶菌液很难和细菌液充分混合，导至溶菌不彻底的问题，这样会造成质粒的回收率比较低；

    而如果细菌溶度比较低，溶菌液和菌液均分混合，会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片，在这样的情况下，沉淀时质粒回合这些物质共沉，进而导至质粒的回收率也会比较低。

    在生物学的相关研究之中，细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作，主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面对碱裂解法进行介绍。

    碱裂解法

    碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒DNA提取方法，这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高，操作便捷，缺点是需要较长的提纯时间。研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究，但是没有得到理想的效果，当前这一方法提取DNA的时间都在1.5h以上。

    碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选，在菌液中加入溶液Ⅰ，细菌细胞悬浮，同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+鳌合，起到抑制DNase活性的作用；然后，加入溶液Ⅱ，将细胞裂解，在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质；

    再次，加入溶液Ⅲ，使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀，并使得质粒DNA复性。其中，该方法中起到裂解细菌作用的主要是溶液Ⅱ中的NaOH，正因如此该方法被称为碱裂解法，如果将其换为SDS，也能够提取出少量的质粒DNA，这是由于SDS也是碱性的，可以一定程度上破坏细菌的细胞膜。

    在这一方法中需要注意，NaOH溶液要现用现配，这个主要是由于其能够和空气中的CO2反应，从而使溶液的碱性降低，这样会影响提纯的效率。

    另外在加入溶液Ⅱ之后，操作时间不能够过长，这是因为染色体DNA在碱性条件下片段会慢慢断裂。另外需要注意的是，在操作过程中，混匀是一定要轻柔，从而在保证细菌沉淀可以充分的扩散在试剂中的前提下，避免已变性质粒DNA和染色体基因组DNA被机械剪切。

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