干货分享 | 常用PCR技术及原理

生物科研实验室

1、PCR

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体系中加入dNTP、Mg2+以及延伸因子、扩增增强因子，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。

2、热启动PCR

常规PCR的扩增开始时间并不是放进PCR仪，运转程序才开始扩增。当体系配置完成的时候，扩增就开始了，这可能会引起非特异性扩增出现，热启动PCR可以解决这一问题。什么是热启动PCR？当反应体系配制好后，在反应初始加热阶段或“热启动”阶段，酶修饰物在高温下（通常高于90 ℃）被释放，使得DNA聚合酶被激活。具体激活时间和温度取决于DNA聚合酶以及热启动修饰物的性质。该方法主要利用抗体、亲合配体、或化学修饰物等修饰物，来抑制的DNA聚合酶的活性。由于DNA聚合酶在常温下的活性被抑制，热启动技术为在常温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且无需牺牲PCR反应的特异性。

3、逆转录PCR

逆转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT-PCR)，是从mRNA逆转录成cDNA并以此为模板进行扩增的一种实验技术。实验流程是先提取组织或细胞中的总RNA，以Oligo（dT）为引物，利用逆转录酶合成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

注：oligo(dT)是由数量少于20的脱氧胸苷酸连接而成的核苷酸链，它可以特异性地结合到mRNA的poly(A)尾端(多A尾)，从而使逆转录酶只能逆转录含有poly(A)尾的mRNA。

4、荧光定量PCR

荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR，RT-qPCR）是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。常用的qPCR方法有荧光染料法（SYBR Green I）和探针法（TaqMan）。染料法（常用SYBR Green Ⅰ）：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，没有掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。探针法（常用TaqMan探针）：探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

5、巢式PCR

巢式PCR（Nested PCR）是指利用两套PCR引物进行两轮PCR扩增，第二轮的扩增产物才是目的基因片段。如果第一对引物（外引物）的错配导至非特异性产物被扩增，相同的非特异性区域被第二对引物识别并继续扩增的可能性非常小，所以通过第二对引物的扩增，PCR的特异性得到了提升。进行两轮PCR的一个优势在于：有助于从有限的起始DNA中扩增得到足量的产物。巢式PCR的实验原理为根据DNA模板序列设计两对引物，利用第一对引物（称为外引物）对靶DNA进行15-30个循环的标准扩增；第一轮扩增结束后将一小部分起始扩增产物稀释100-1000倍加入到第二轮扩增体系中作为模板，利用第二对引物（称为内引物或巢式引物，结合在第一轮PCR产物的内部，进行15-30个循环的扩增，第二轮PCR的扩增片段短于第一轮。