实验技巧 | 7种较常见的流式疑难问题解析

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1. 无信号/荧光强度弱

信号补偿不正确

检查流式细胞仪上单色阳性对照是否设置正确，以及门控和补偿设置是否正确，确保您能捕获所有事件。

用于检测的抗体不足

增加抗体量或抗体浓度。

无法接近细胞内靶标

检查靶蛋白是否是位于细胞内，或者膜蛋白的抗体表位是否位于细胞内。关于细胞内染色，确保充分透化。为防止细胞表面蛋白质发生内化，所有操作步骤必须在冰上或 4℃ 下用预冷的交联试剂完成，以阻止所有细胞反应。

在实验试剂中添加叠氮化钠可阻止表面抗原的调变和内化，但会导至荧光强度损失。对于粘附细胞系的染色，胰蛋白酶通常可以诱使细胞表面蛋白发生内化，并且可能需要更温和的分离方法。

细胞内染色 - 荧光染料结合分子太大

细胞内染色实验应使用小分子量的荧光染料。分子量大的荧光染料会降低抗体活性，阻止抗体进入细胞标记目标蛋白。

激光器未对齐

确保流式细胞仪上的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查微珠来调整路线。如果激光器未正确对齐或发生偏移，则可能需要考虑维修机器。

靶蛋白不存在/低水平表达

确保您正在分析的组织/细胞类型能表达靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被检出。

可溶性/分泌性靶蛋白

靶蛋白是否可溶并由细胞分泌？靶蛋白需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里，以便轻松通过流式细胞术检出。通过高尔基体封闭步骤，例如加入 Brefeldin A，可以改善细胞内的染色信号。

补偿过高/增益过低

使用阳性对照正确设置流式细胞仪，利用补偿确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理范围内 - 应谨慎操作）。

荧光染料的荧光消退

抗体可能存放太久或没有避光。需要新鲜抗体。

一抗和二抗不匹配

使用的二抗应与一抗来源种属不同（例如，一抗为兔源，则应该使用抗兔源二抗）。为了解决种属交叉反应性的问题，您可以使用经流式细胞术验证的直接偶联一抗，或者使用偶联物试剂盒，在您选择的抗体中加入合适的荧光染料。

2. 荧光强度高

抗体浓度过高

会导至强非特异性结合或高荧光强度。减少每个样本中添加的抗体量。

过量抗体被捕获

可能是胞内染色特有的问题，这种情况下，抗体上的大荧光染料分子可能被捕获在细胞内。确保洗涤步骤充分，并在洗涤缓冲液中加入吐温或Triton，以保持细胞的透化作用。

封闭不足

在您的抗体混合液中加入1%-3%封闭剂，并增加封闭步骤。

3. 背景高/阳性细胞百分比高

增益设置过高/补偿过低

使用阳性对照正确设置流式细胞仪，使用补偿减少小颗粒背景信号并减少增益，以降低信号。

抗体过量

降低抗体浓度。还可以在洗涤缓冲液中添加去污剂，确保洗去过量的抗体。

4. 在应该只有一个细胞群的情况下观察到两个或多个细胞群

表达靶蛋白的细胞群不止一个

检查样本包含的细胞类型的预期蛋白表达水平，如有必要，确保细胞充分分离。

出现细胞双峰

细胞双峰显示为第二大细胞群，其荧光强度大约是单细胞荧光强度的两倍。染色前用移液枪将细胞轻柔混匀，放入细胞仪中运行前再次混匀。也可以筛选或过滤细胞，以去除团块（30μL尼龙网）。

5. 侧向散射背景偏高（来自小颗粒）

细胞裂解

确保样本中的细胞没有裂解和破碎。样本应新鲜，并正确制备。不要在高转速的情况下对细胞进行离心或激烈涡旋。

细菌污染

确保样本不受污染。细菌会自动发出较弱的荧光，导至高事件率。

6. 低事件率

每毫升的细胞数过少

运行1×106个细胞/mL。确保细胞混合均匀（轻柔混匀）。

细胞聚集，阻塞管道

染色前轻轻吹打几次，确保得到同源单细胞悬液。确保上机前再次混匀。极端情况下，可以筛选或过滤细胞，以去除团块（300目尼龙网）。

7. 高事件率

细胞数量过多

稀释至1×105至1×106个细胞/mL。