实验技巧 | 收藏铁死亡检测的关键指标，助力发表SCI文章

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01、亚铁离子检测

细胞铁积累是铁死亡的典型标志之一，亚铁离子积累可以特异性地增加氧化应激水平。例如，在研究氧化应激介导的视网膜色素上皮 (RPE) 变性的潜在机制时，通过用 FerroOrange 染色细胞 (亚铁离子探针)，结果表明 NaIO3和Erastin处理的细胞积累了过多的亚铁离子，说明诱导了铁死亡，而Fer-1或DFO预孵育可以抑制亚铁离子的积累，如图所示。结果表明铁死亡是氧化应激介导的RPE变性的主要病理过程。

02、活性氧ROS检测

ROS和脂质ROS在铁死亡中起关键作用，文献报道增加的超氧化物歧化酶 (SOD) 可抑制体内的ROS水平。细胞内会由于铁的积累而抑制抗氧化系统，铁可能直接通过Fenton 反应产生过量的ROS，从而增加氧化损伤。因此 ROS检测也是常用方法。

03、脂质过氧化物

除了ROS检测，铁死亡的脂质过氧化的指标还有谷胱甘肽 (GSH) 合成的变化、脂质过氧化物 (MDA, LPO) 水平的变化。

在遗传性血色素沉着症 (HH，一种铁超负荷疾病) 与铁死亡的关系研究中，为了证实铁死亡在 HH 相关肝损伤中的作用，作者用铁死亡抑制剂 Fer-1 治疗 Hjv–/– 小鼠 (经典的 HH 小鼠模型) 和 Smad4 Alb/Alb 小鼠 (HH 样小鼠模型) 三周。如图上图所示，与对照组小鼠相比，经 Fer-1 处理的小鼠肝脏 MDA 水平显著降低，NADPH 水平增加。此外，Fer-1 可以降低小鼠血清ALT水平胶原蛋白沉积。结果表明，铁超载会诱导 HH 小鼠的铁死亡。

04、谷胱甘肽代谢

在DJ-1 suppresses ferroptosis through preserving the activity of S-adenosyl homocysteine hydrolase 一文中，作者探究了DJ-1 负调节铁死亡的机制。研究发现，用RNA干扰抑制DJ-1表达可以与Erastin协同抑制细胞内GSH水平(图A)。同时，添加外源性GSH或N-乙酰半胱氨酸 (NAC)可以逆转Erastin诱导的脂质ROS积累 (图 B) 和细胞死亡 (图 C)。因此，作者推测DJ-1可能会影响GSH的合成从而抑制铁死亡。

05、常见的细胞表型检测

铁死亡会导至细胞死亡。因此一般在铁死亡的研究中，检测细胞活力是常见方法，同时也会通过染色等方法来观察细胞膜通透性，线粒体形态等。如在 Identification of Frataxin as a regulator of ferroptosis 一文中，作者研究抑制Frataxin (FXN) 是否会促进铁死亡。用Erastin同时处理 FXN 敲低和对照细胞，12小时后用CCK8法检测细胞活力，结果表明抑制FXN 表达显著增强了Erastin诱导的细胞死亡。同时碘化丙啶 (PI) 和 CFDA-SE 染色结果以及用透射电镜观察到的线粒体碎裂、空泡化和嵴增大都表明FXN 耗竭协同Erastin诱导铁死亡。

06、铁死亡相关蛋白表达

qRT-PCR/WB检测与铁死亡相关的蛋白表达，如PTGS2、NOX1、FTH1、COX2、GPX4、ACSL4等，其中COX2、ACSL4、PTGS2、NOX1在铁死亡细胞中表达上调，GPX4.FTH1在铁死亡细胞中表达下调。