WB检测常见问题解析

xiaoqin

WB又叫蛋白质印迹，是一种用于检测样本（如细胞提取物或组织匀浆）中特异性蛋白的技术，也用于分析体外合成的重组蛋白。蛋白免疫印迹法还可以根据某种抗原与其相对抗体之间的特殊亲和力来鉴定靶蛋白。蛋白免疫印迹法一般包含三个主要步骤分别为SDS-PAGE、样品印迹和免疫学检测。通过蛋白免疫印迹法可以获得关于靶蛋白的定性和半定量数据。在蛋白质领域，蛋白免疫印迹法被广泛用于蛋白表达水平的检测。下面是关于蛋白质印迹WB的常见问题解析：

1、为什么抗磷酸化酪氨酸抗体会出现高背景或信号减弱？

检查您所使用的封闭液。脱脂奶粉适用于除磷酸化酪氨酸印迹外的所有印迹，磷酸化酪氨酸印迹具有与膜结合的磷酸化蛋白。使用该试剂进行封闭，潜在的表位会出现在印迹结果里。在该溶液中稀释抗磷酸化酪氨酸抗体将占据许多表位，可用于检测的抗体较少。我们建议使用含1% BSA的TBS，含吐温20作为封闭液，请勿使用牛奶。

2、为什么随着时间的推移，蛋白免疫印迹法中的抗体活性会降低？

如果您使用我们的一种抗体进行蛋白免疫印迹分析，并且反应性似乎随着时间的推移而降低，需要考虑的要点是：

可能的原因及解决方案：

①原因一：使用了不同的样本。

解决方案：培养的细胞会随着时间的推移而变性，因此我们建议解冻新鲜细胞。

②原因二：样品在储存期间或反复冻融后降解。

解决方案：制备新鲜样品，避免反复冻融。

③原因三：抗体被污染。

解决方案：旋转小瓶，检查是否有沉淀。

④原因四：第二步的试剂不起作用。

解决方案：更换第二步的试剂。

⑤原因四：样品在储存过程中或在反复冻融后降解。蛋白质转印无效。

解决方案：转印后用墨汁对印迹进行染色，确认蛋白从凝胶转印到印迹。请注意，抗体非常稳定，如果适当储存，不太可能随时间“消失”。

3、如何避免转印不充分或结果不理想的问题？

确定蛋白质的大小。如果蛋白质大于180 kDa，则需要通过以下方式优化转印条件：

• 使用20% MeOH。

• 加入0.05% SDS转印缓冲液。

• 增加裂解物的上样量。

• 在1 A转印电压下转印1小时。

4、如何避免“斑点状”或不均匀的蛋白免疫印迹？

为避免进行蛋白免疫印迹法时出现“斑点状”或不均匀的印迹，有以下几种方法:

• 延长封闭时间，以优化封闭效果。

• 延长洗涤次数 （这对组织匀浆样品尤为重要）。

• 在加入印迹之前，确保奶粉完全溶于溶液。

• 在取出抗体溶液使用之前，旋转装有抗体溶液的试管，防止出现蛋白沉淀。

5、蛋白免疫印迹法应使用哪种印迹膜？

我们建议使用硝酸纤维素膜。虽然PVDF和其他类似的膜也可以使用，但有时会产生升高的背景，特别是山羊多克隆制剂。

6、应该使用什么封闭缓冲液？

我们建议使用1X TBS、5%牛奶、0.05%吐温-20。在室温下封闭30-60分钟或在4℃下封闭过夜。请注意，如果孵育过夜，缓冲液中应不含吐温。

7、该抗体是否会在不同物种中与同种靶蛋白发生交叉反应吗？

义翘神州所有抗体的主要种属反应性均通过蛋白免疫印迹分析来确定。这主要使用来源于原代种属的细胞系或组织进行。这主要使用源自主要物种的细胞系或组织进行。义翘神州网站上可查询主要种属反应性以及所使用的验证组织数据表。

义翘神州提供Western Blot检测服务，服务内容包含：检测纯化蛋白、细胞或细胞裂解液、组织及组织裂解液、Sally Sue高通量检测服务；更多详情可以参看：https://cn.sinobiological.com/services/western-blot-wb-service