流式无信号/荧光强度弱是怎么回事

科研实验

信号补偿不正确

检查流式细胞仪上单色[color=var(--weui-LINK)][url=]阳性对照[/url]是否设置正确，以及门控和补偿设置是否正确，确保您能捕获所有事件。

用于检测的抗体不足

增加抗体量或抗体浓度。

无法接近细胞内靶标

检查靶蛋白是否是位于细胞内，或者膜蛋白的抗体表位是否位于细胞内。关于细胞内染色，确保充分透化。为防止细胞表面蛋白质发生内化，所有操作步骤必须在冰上或 4℃ 下用预冷的交联试剂完成，以阻止所有细胞反应。

在实验试剂中添加[color=var(--weui-LINK)][url=]叠氮化钠[/url]可阻止表面抗原的调变和内化，但会导至荧光强度损失。对于粘附细胞系的染色，胰蛋白酶通常可以诱使细胞表面蛋白发生内化，并且可能需要更温和的分离方法。

细胞内染色 - [color=var(--weui-LINK)][url=]荧光染料[/url]结合分子太大

细胞内染色实验应使用小分子量的荧光染料。分子量大的荧光染料会降低抗体活性，阻止抗体进入细胞标记目标蛋白。

激光器未对齐

确保流式细胞仪上的激光器正确对齐，必要时通过运行液流检查[color=var(--weui-LINK)][url=]微珠[/url]来调整路线。如果激光器未正确对齐或发生偏移，则可能需要考虑维修机器。

靶蛋白不存在/低水平表达

确保您正在分析的组织/细胞类型能表达靶蛋白，并且靶蛋白的量足以被检出。

可溶性/分泌性靶蛋白

靶蛋白是否可溶并由细胞分泌？靶蛋白需要嵌合在细胞膜上或存在于细胞质里，以便轻松通过流式细胞术检出。通过[color=var(--weui-LINK)][url=]高尔基体[/url]封闭步骤，例如加入 Brefeldin A，可以改善细胞内的染色信号。

补偿过高/增益过低

使用阳性对照正确设置流式细胞仪，利用补偿确保细胞的荧光信号不被切断，提高增益以增强信号（在合理范围内 - 应谨慎操作）。

荧光染料的荧光消退

抗体可能存放太久或没有避光。需要新鲜抗体。

一抗和二抗不匹配

使用的二抗应与一抗来源种属不同（例如，一抗为兔源，则应该使用抗兔源二抗）。为了解决种属交叉反应性的问题，您可以使用经流式细胞术验证的直接偶联一抗，或者使用偶联物试剂盒，在您选择的抗体中加入合适的荧光染料。