原核蛋白表达的整体实验流程和具体实验结果

宋宋030688

一、假设目标蛋白的信息

名称：  XXX蛋白      

大小：  30 kDa      

缓冲液：PBS           

浓度：  0.6mg/mL   

体积：  6mL （3管分装）

标签:   仅6Xhis      

纯度：  90%以上

二、实验过程

1蛋白表达载体的构建

1.1 序列二基因序列密码子优化后合成及构建

Optimized for your reference:

CATATGxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxCTCGAG

合成时候带上上下游酶切位点分别是Nde I，Xho I（黄色阴影），并克隆到原核表达载体Pet24a载体。

1.2 DNA测序

将经菌落PCR鉴定为阳性克隆测序，测序工作由华大基因完成（见附件）。

2 构建正确的Pet24a-序列二表达载体在大肠杆菌中的表达

2.1 转化至大肠杆菌BL21(DE3)

常规CaCl2法。

2.2 IPTG诱导融合蛋白的表达

2.2.1 挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/ml Kan的3 ml LB培养液的试管中，37℃ 220 rpm振摇过夜；      

2.2.2 次日按1：100接种于50 μg/ml Kan的30 ml LB培养液中，37℃ 220 rpm振摇至菌体OD600为0.4 (约2h)；

2.2.3 取出1 ml培养物，12000g室温离心2 min，弃上清，用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；

2.2.4 向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.5 mmol/l，37℃ 220 rpm振摇4 h，诱导序列二蛋白表达；

2.2.5取出1 ml培养物，12000g室温离心2 min，弃上清，用100 μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀，剩余培养物4℃ 4000g离心12 min，弃上清，沉淀置-20℃冻存。

2.3 表达产物分布的确定

2.3.1 将表达菌体重悬于400 μl Ni-IDA Binding-Buffer(20 mM Tris-HCl，5 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)；

2.3.2 重悬液进行超声波破碎(冰浴中进行)：功率100 W，工作4 sec，间歇8 sec，共10 min；

2.3.3 超声破碎液4℃ 12000g离心20 min，取10 μl上清液加入等量的2×上样缓冲液，沉淀用400 μl 1×上样缓冲液重悬后取5 μl，恒压150 V进行12% SDS-PAGE，考马斯亮蓝R250染色显带。

3融合蛋白的纯化

3.1 将1 L诱导表达的培养菌体沉淀用20 ml Ni-IDA Binding-Buffer重悬后，超声破碎(功率200 W，工作4 sec，间歇8 sec，共20 min)，4℃ 12000g离心20 min，取上清；

3.2 利用Biologic LP层析系统，上清液以0.5 ml/min流速上样至Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱；

3.3 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

3.4 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，30 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；

3.5 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.5 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；

3.6 进行12% SDS-PAGE分析。

三、实验结果

SDS-PAGE结合考染鉴定纯化的XXX蛋白

1-4泳道分别指XXX蛋白放大表达后的全菌、破碎上清、纯化时20mM咪唑洗脱液以及250mM咪唑洗脱液。