免疫组化实验

与光同辉

免疫组化（IHC）


免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是基于抗原抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色来对组织内抗原进行定位、定性、定量的一项技术。



根据抗原抗体反应和化学显色原理。从待测组织或细胞中提取蛋白作为抗原，先与一抗结合形成抗原抗体反应物，再与生物素或荧光素标记的二抗反应，通过化学显色可以在显微镜下清晰观察到抗原抗体反应物，从而能在组织切片上确定抗原的分布和含量。
免疫组化的分类


根据抗体标记物的不同一般分为免疫酶标法、免疫荧光法、亲和组织化学法、免疫铁蛋白法、免疫金法、放射免疫自影法。下面介绍两种较为常用的两种技术：

免疫荧光法

免疫荧光法是最早建立的免疫组织学技术。将已知抗体标上荧光素，以此作为探针，检查细胞或组织内的相应抗原。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后会发出一定波长的荧光，从而对组织中的抗原进行定位或定量。



免疫酶标法

免疫酶标法是继免疫荧光之后发展的应用较为广泛的免疫组化技术。先以酶标记的抗体作用于组织或细胞，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性物质或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对其进行定位，从而对细胞内抗原进行定位或定性研究的一种方法。



免疫组化的应用


IHC的原理是通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究。人体内很多器官和组织内的组成细胞，由于起源一致，在形态结构上非常相似，很多时候是很难靠形态来区分。在过去没有免疫组化的情况下，识别有很强的主观性，错误难以避免。免疫组化就像细胞的“血型”鉴定，靠它可以明确组织来源。由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高、定位准确等特点，且能将形态研究与功能研究有机结合在一起，所以这门新技术已被广泛应用于生物学和医学研究的许多领域。免疫组化在病理学诊断中的应用主要包括：



确定细胞类型

辨认细胞产物

了解分化程度

鉴定病变性质

探讨肿瘤起源或分化表型

确定肿瘤分期等

免疫组化材料的准备


切片的选择

    1.石蜡切片：通过石蜡包埋固定好的组织标本，并用切片机切片的方法。是制作组织标本最常用、最基本的方法。能保存好组织形态且可以做连续切片，有利于各种染色对照观察，并且可以长期存档做回顾性研究。但高温烤片可能会破坏组织的抗原性。

    2.冰冻切片：在低温条件下使组织快速冷冻到一定的硬度，然后进行切片的一种方法。能较好保存组织的免疫活性，在免疫组化时不需要抗原修复。但细胞内易形成冰晶破坏细胞结构，可能会使抗原弥散，切片较厚不美观。

         

抗体的选择

    1.单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色。

    2.种属来源：根据一抗的来源决定二抗的选择。若一抗是小鼠来源，那么二抗选择抗小鼠的即可（例如羊、兔）。

   3.根据实验目的是检测什么种属的抗原选择抗体，避免出现交叉反应。   

   4.购买之前咨询该抗体是否可以做免疫组化。

   5.一般可以做石蜡切片的抗体都可以用来做检测冰冻切片，但可以做冰冻切片的抗体不一定能检测石蜡切片。
实验步骤主要包括样品制备以及样品染色（以石蜡组织切片为例）



样品制备

组织固定：根据要求收集人或动物的组织用于IHC分析，冲洗并用固定剂（一般用甲醛）进行固定

组织包埋：将经甲醛固定的组织嵌入石蜡，以长期保持其天然形状和组织结构

切片安装：将组织样品在切片机上切片，并转移至载玻片上干燥保持其形态

脱蜡水化：因切片上的石蜡会妨碍染色，所以需将切片上的石蜡溶出，并水化。脱蜡或水化不全容易造成非特异性背景着色（一般的脱蜡水化步骤是：将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min-二甲苯Ⅱ10min-无水乙醇5min-95%无水乙醇5min-90%无水乙醇5min-80%无水乙醇5min-70%无水乙醇5min-50%无水乙醇5min-蒸馏水5min×3，进行脱蜡水化）。

抗原修复：由于组织在甲醛固定过程中，蛋白之间发生了交联及醛基的封闭从而掩盖抗原决定簇。可以通过高压加热修复抗原，使细胞内抗原决定族暴露，从而提高抗原检测率。

非特定位点封闭：为了防止一抗的非特异性结合造成假阳性，可以选用BSA、羊血清等封闭非特异性结合位点。封闭血清来源一般与二抗保持一致，室温封闭10-30min。



样品染色

一抗、二抗孵育：抗体孵育时间、温度及浓度等因素对染色结果都存在很大影响。在4℃下反应缓慢，背景较浅；37℃反应较快时间较短；而室温介于两者之间，选择室温有利于实验的进行。二抗一般室温孵育30min。

底物显色：基于与酶缀合的二抗，抗原通过生色或荧光方式直接检测。

复染封片：组化染色后进行复染可以衬托出组织形态结构，常用的复染剂有苏木精、曙红、甲基绿、DAPI和Hoechst荧光染色。观察结束后使用中性树胶进行封片，可以长久保存。

常见问题分析


1. IHC实验结果显色过深

一抗浓度过高或孵育时间过长——降低一抗浓度或减少孵育时间

孵育温度过高——选择4℃或室温孵育

2. 实验结果存在非特异性显色

石蜡切片脱蜡不彻底——延长脱蜡时间

蛋白封闭不充分——增加蛋白封闭时间

组织富含内源性生物素与过氧化物酶——使用相关试剂进行封闭

3. 实验结果显色弱或无染色

一抗浓度过低或孵育时间过短——增加一抗浓度或延长孵育时间

组织中无目的抗原的表达

一抗种属来源与二抗不匹配

注意事项

切片脱蜡和水化要充分，加反应液时要覆盖组织充分；每次加液前甩干洗涤液，同时防止干片。

一抗的冲洗原则：单独冲洗，防交叉反应污染；温柔冲洗，防止切片脱落；推荐浸洗方式。

有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。