热启动酶原理及耐热机制

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热启动酶（Hot start enzyme）主要利用酶的修饰物在常温下抑制DNA聚合酶的活性，加热至变性温度时修饰物失活，释放酶活，从而使PCR反应得以正常进行。目前市面上常用的DNA聚合酶热启动修饰方法主要有化学修饰、配体修饰和抗体修饰等，不同的热启动修饰方法原理上有所区别，各有优劣势。

化学法

DNA聚合酶的化学法修饰，一般采用化学小分子如酸酐等有机物与聚合酶上的侧链氨基酸（赖氨酸）通过化学反应相互作用，使酶低温时失去酶活，温度升高后，酸酐与氨基之间的化学键断裂，酶活释放，从而达到热启动效果。化学修饰可有效封闭酶的活性，操作简单，但酶活性释放速度较慢，依赖温度激活DNA聚合酶，能有效抑制非特异性产物，可在室温下配置反应体系，且对PCR反应buffer要求较高。

图1. 化学法修饰热启动酶原理图

配体法

配体法修饰，主要借助核酸适配体封闭酶活。顾名思义，核酸适配体一般指一类具有特异性识别功能的单链核酸分子，可以是RNA也可以是DNA，长度一般为25～60个核苷酸。作为一种寡核甘酸序列的识别分子，作用的靶分子范围广泛，从无机金属的小分子到生物领域的大分子。这些适配子可以形成特定的空间构象，从而在表观功能上与抗体类似。对蛋白质或其他小分子物质具有高度特异性、亲和力。核酸适配体通过非共价键与DNA聚合酶结合，进而抑制聚合酶在非许可温度下的聚合反应。一般核酸适配体的筛选所需周期较短，整个过程能够依赖自动化，简便快捷。

图2. 配体法修饰热启动酶原理图

抗体法

抗体法热启动酶一般考虑使用DNA聚合酶抗体封闭酶活性，使其在低温时处于无活性状态，在加热至变性温度时抗体变性，解除封闭从而释放活性，可以大大避免错配或引物二聚体引起的非特异性扩增。另一方面针对低丰度基因，封闭抗体在避免预变性前的DNA聚合酶和模板的非特异性结合的同时，增加了引物与微量的正确模板碰撞退火的效率，从而保证低丰度基因的有效检出，大大提升反应灵敏度和扩增效率。

图3. 抗体法修饰热启动酶原理图

表1. 热启动酶常见修饰方法优劣势比较

酶活封闭类型	化学修饰	配体修饰	抗体修饰
原理	化学小分子和DNA聚合酶活性中心结合封闭酶活	核酸适配体通过非共价键作用与聚合酶结合封闭酶活	DNA聚合酶抗体与聚合酶结合封闭酶活
酶活释放条件	温度：大于95 ℃ 时间：10-15 min	温度：大于60 ℃ 时间：1-5 min	温度：大于70 ℃ 时间：30 s-5 min
优点	酶活性维持更加稳定且无任何外源DNA污染，性价比较高。	不需要激活步骤，稳定性高，减少样品降解的可能性。	酶激活时间短，保证酶活，亲和力强，灵敏度高。
缺点	酶激活时间较长可能会影响酶的活性，导至PCR产物的产量降低。	核酸配体是一种可逆抑制剂，不如化学修饰法稳定，特异不够强。	抗体修饰是一种动态平衡，抗体生产成本高，试剂配比优化时间长。

以上简单介绍了热启动酶的常见类别和各种热启动方法的优劣势，其中化学修饰物不能够批量合成，而且需要较长的激活时间聚合酶才能释放酶活。配体修饰DNA聚合酶只在20-25°C效果较好，到40°C时，聚合酶的活性就被释放出来，特异性不好；而抗体法修饰热启动酶对应的封闭效果最佳，酶活释放速度快，从而大大降低PCR反应时间，是目前IVD市场上应用较多的一种热启动酶改造方法。

来源：翌圣生物