胶体金法粪便隐血检测试剂的性能检测及初步临床应用评估

临床医师

复旦大学附属肿瘤医院检验科     杨琳，卢仁泉，郭林

       摘要：目的　评价胶体金法粪便隐血检测试剂的性能及临床应用价值。方法　随机选择１５０例住院患者粪便样本，分别用试验试剂［胶体金法，梅里埃（上海）生物制品有限公司生产］和对照试剂（胶体金法，上海凯创生物技术有限公司生产）对样本进行检测，并对结果进行统计。同时结合患者临床资料，对检测结果的符合程度进行综合分析，初步评估其临床应用价值。结果　试验试剂敏感性可达到４０ｎｇ／ｍＬ，特异性和重复性均符合要求，与对照试剂结果基本相符，且检测结果与临床病情相符合。结论　胶体金法粪便隐血检测试剂方法简便，结果可靠，可进一步应用于临床。
       关键词：粪便隐血；胶体金法；性能分析

       结直肠癌在世界范围内的发病率已高居第３位，是癌症死亡最主要的原因之一。粪便隐血试验是临床诊断消化道出血性疾病的一个重要方法，也是实验室常规开展的项目之一，更是筛选结直肠肿瘤的有效手段。临床实验室检测粪便中的血红蛋白方法有很多，其中免疫胶体金法是目前最常用的方法。我们对一种新的粪便隐血试剂用于检测人粪便中血红蛋白的性能进行了初步评价。

材料和方法

一、材料

       １．粪便隐血检测试剂　梅里埃（上海）生物制品有限公司生产的粪便隐血检测试剂（胶体金法，４０ｎｇ／ｍＬ，简称试验试剂），批号１１０７２２６０９；已获得国家注册批文［沪食药监械（准）字２００９第２４０１３３８号］的上海凯创生物技术有限公司生产的粪便隐血检测试剂（胶体金法，４０ｎｇ／ｍＬ，简称对照试剂），批号Ｓ２０１１０７００５。
       ２．粪便隐血胶体金试剂标准品　梅里埃（上海）生物制品有限公司提供的标准品（ＤｉｍａＦＯＢｓｗｓ），批号１１１８９Ｔ，－２０℃保存。
       ３．其他试剂　美国Ｓｉｇｍａ公司生产的人白蛋白（２ｍｇ／ｍＬ）和人免疫球蛋白（１ｍｇ／ｍＬ）各１瓶。志愿者静脉血１ｍＬ，经血液分析仪检测血红蛋白含量为１３０ｇ／ｍＬ。
       ４．临床粪便样本　１５０例粪便样本从复旦大学附属肿瘤医院２０１１年８至９月住院患者中随机收集，其中男８３例，女６７例，年龄２２ ～８１岁，包括肝胆胰腺癌５８例、胃癌２１例、结直肠癌２２例、肺及食道癌１４例、鼻咽癌１３例、乳腺癌９例、恶性淋巴瘤５例、其他恶性肿瘤８例。
       ５．粪便样本的处理　分别使用试验试剂盒和对照试剂盒中所附的收集管收集粪便样本２ｇ。用收集管内螺旋杆分别在粪便样本的３个不同位置取样，将带有样本的螺旋杆放入收集管中并封住管口，摇匀，取粪便混悬液即为粪便样本。

二、方法

       １．敏感性试验　将１０μｇ／ｍＬ粪便隐血检测试剂标准品按不同比例用粪便隐血检测试剂缓冲液分别稀释成１０００、２００、１００、４０、２０ｎｇ／ｍＬ共５个浓度，将以上浓度工作液分别滴加４滴于试验试剂板上，５ｍｉｎ后判读结果。出现结果后，将阴性及弱阳性结果的工作液分别滴加于５块试剂板上，确定其Ｃｕｔ-ｏｆｆ值。
       ２．特异性试验　将志愿者静脉血、２ｍｇ／ｍＬ人白蛋白、１ｍｇ／ｍＬ人免疫球蛋白及蒸馏水分别滴加４滴于试验试剂板上，５ｍｉｎ后判读结果。
       ３．重复性试验　将２０、４０、１０００ｎｇ／ｍＬ３个不同浓度的粪便隐血检测试剂标准品各测定１０次，５ｍｉｎ后判读结果。
       ４．临床样本测定　按双盲法将试验试剂和对照试剂分别检测，进行结果统计。揭盲后将不符合的样本与标准品一起用聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＳＤＳ?ＰＡＧＥ）进行分析。以上所有样本均严格按试剂说明书进行测定。

结　果

一、敏感性试验

       当标准品浓度为２０ｎｇ／ｍＬ时呈阴性反应；当浓度达到４０ｎｇ／ｍＬ时呈弱阳性反应；当浓度达到１００、２００、１０００ｎｇ／ｍＬ时均呈阳性反应。见表１。重复５次检测其阴性浓度及弱阳性浓度，确定其Ｃｕｔ-ｏｆｆ值为４０ｎｇ／ｍＬ。

二、特异性试验

       试验试剂对人血呈阳性反应，对２ｍｇ／ｍＬ人白蛋白、１ｍｇ／ｍＬ人免疫球蛋白和蒸馏水呈阴性反应。

三、重复性试验

       ４０、１０００ｎｇ／ｍＬ粪便隐血检测试剂标准品用试验试剂各测定１０次，均呈阳性反应，质控线清晰，显色深度均一，无明显差异；浓度２０ｎｇ／ｍＬ的标准品滴加后的试验板条均呈阴性反应，质控线清晰。测定结果符合重复性要求。见图１。

四、临床样本测定

       １５０例临床样本中试验试剂呈阳性反应４６例、阴性反应１０４例；对照试剂呈阳性反应４５例、阴性反应１０５例。试剂阳性符合率为１００．００％，阴性符合率为９９．０５％，结果基本相符，见表２。其中１例不符合样本经ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析与标准品条带一致，证实其确为阳性结果。上述阳性病例中，经临床病史确认，多为有出血倾向的恶性肿
瘤。见表３。

讨　论

       粪便隐血试验是诊断消化道出血的一种重要检测方法，对于消化道肿瘤的早期诊断具有重要意义。近年来，随着免疫学方法在临床上的逐步应用，胶体金法的粪便隐血试剂条越来越广泛地应用于临床。胶体金法已被世界卫生组织和世界胃镜检查协会推荐作为粪便隐血试验的检测方法。由于其不受动物血红蛋白和过氧化物酶的干扰，因而不需控制饮食，还具有敏感性高、特异性好等优点，是目前临床上较为理想的粪便隐血检测方法。
       梅里埃（上海）生物制品有限公司生产的粪便隐血检测试剂，其原理为双抗体夹心法，试剂中含有被预先固定于膜上测试区的抗血红蛋白单克隆抗体和控制区的相应抗体。本研究对该试剂进行了性能分析，其敏感性为４０ｎｇ／ｍＬ，对人血红蛋白有高度的特异性，重复性试验显示其显色条带颜色均一，稳定性好。有文献报道胶体金法隐血试验阳性率为２３％，本研究中１５０例肿瘤患者粪便样本试验试剂的阳性率达到３０．７％（４６／１５０），阳性及阴性符合率与对照试剂基本相符，其中１例不符的样本经ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析与标准品条带一致，证实为阳性结果。阳性率较高的病例为胃癌（４２．９％）、结直肠癌（５４．５％）、肝胆胰腺癌（３２．７％）等消化道肿瘤及有出血倾向的恶性肿瘤，经临床病史确认其阳性结果符合患者实际病情。该试剂对血红蛋白含量不同的粪便样本能呈现出深浅不同的阳性条带结果，有助于临床对疾病治疗进展的判断。本研究中胶体金法的最低检测限为４０ｎｇ／ｍＬ，但仍有１例样本出现了假阴性结果，原因为该份样本血红蛋白浓度过高而出现前带现象，稀释１００倍后方出现阳性反应。所以当粪便颜色过深且胶体金法为阴性时，需用蒸馏水稀释后进行检测。
       胶体金法粪便隐血检测试剂方法简便，结果可靠，具有一定的临床应用前景。