今日分享：实验技巧 | 细胞划痕，满满干货

与光同辉

细胞划痕法是简捷测定细胞迁移运动和修复能力的方法。

一、原理

在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上，用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间，取出细胞培养板，在显微镜下观察并拍照记录特定位置细胞的生长迁移能力。

通过不同分组之间的细胞对于划痕区修复能力的不同，可以判断各组细胞的迁移与修复能力的差别。

二、步骤

1、准备：

所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和 marker 笔在操作前紫外照射 30 min（超净台内）



2、流程：


1. 培养板划线：先用 marker 笔在 6 孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔 0.5~1 cm 一道，横穿过孔，每孔至少穿过 5 条线；


2. 铺细胞：在孔中加入约 5×105 个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满；


3. 细胞划线：第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜；


4. 洗细胞：用 PBS 洗细胞 3 次，去除划下的细胞，加入无血清培养基；


5. 细胞培养及观察：放入 37℃、5% CO2 培养箱，培养；按 0，6，12，24 小时取样，倒置显微镜观察特定位置细胞迁移情况并拍照；


6. 结果分析：使用 Image J 软件打开图片后，随机划取 6-8 条水平线，计算细胞间距离的均值。

三、注意事项


1、铺细胞最好使用 6 孔板，因为 6 孔板可以保证有相当距离的平直划痕，而且因为有 5 条定位线，与划痕相交，这样就有10 个可固定监测点，不作重复，误差也很小。


2、如果你连续监测 24 小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。

如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素（1 ug/ml）处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。另外，使用无血清培养基也可以降低增殖对实验结果的影响。


3、照片拍完之后，可以用 ImageJ 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。


4、虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。


5、应尽量清洗掉散落的细胞，对于一些细胞，低血清浓度下也能重新贴壁并增殖，此外也影响数据美观。

四、常见问题


1.划痕法测量适用的细胞范围较小，一般只适用于上皮细胞，纤维样细胞。


2.虽然无血清培养可以忽略细胞增殖的影响，但是由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。


3、在用 PBS 缓冲液冲洗时，注意贴壁慢慢加入，以免冲散单层贴壁细胞，影响实验拍照结果。


4、一般做划痕实验，需要排除细胞增殖的影响，一般在不影响细胞增殖的情况下采用低血清（<2%）或者无血清，否则细胞增殖就不能忽略，这样对于迁移较慢的细胞就需要延长拍摄时间（也可用丝裂酶处理一小时）。


5、按照 6 孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，作为固定的检测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。


6、每次拍照前、后，尽量换掉培养基，去除飘落的细胞，能得到较为干净的划痕区域。