qPCR的内参，你选对了吗？

与光同辉

荧光定量 PCR 的主要用途之一是对RNA进行相对定量分析，而提到相对定量，必然离不开内参，那什么是内参基因？为什么相对定量必须使用内参基因？如何选择合适的内参基因？今天，小助手聊聊实验室遇到的内参那些事。


一、什么是内参基因？
内参基因，也称为管家基因，即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。所以叫内参基因。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。常用的内参基因包括GAPDH、β-actin、18 sRNA、28sRNA、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。


二、为什么相对定量必须使用内参？
那内参基因与相对定量又有什么样的关系呢？我们通过以下实验案例一起了解一下。

实验目的：测定肝癌细胞A基因相对于正常肝细胞的表达量。通过荧光定量检测可得：肝癌细胞中A基因的CT=25，正常肝细胞中A基因的CT=26，所以，利用表达量倍数计算公式2-△CT计算，发现肝癌细胞中的A基因表达量是正常肝细胞表达量的2倍。

但是，以上结论成立的前提是：必须保证两盘细胞的细胞数量完全一致；RNA提取、逆转录以及qPCR扩增效率完全一致；不存在操作误差等。这显然是无法达到的。



因此，为了将样本处理归一化，引入一个内参进行校正。基于前面对内参基因特点的描述，我们知道内参基因在两类细胞（正常肝细胞/肝癌细胞）中的表达量是相对一致的，所以可以对细胞上样量、细胞上样过程中存在的误差、实验过程中存在的实验误差等进行校正。再来看一下引入内参后A基因的表达量。

肝癌细胞A基因 CT= 25，内参基因CT= 20；正常肝细胞A基因CT= 26，内参基因CT= 22。所以，内参校正后，肝癌细胞中的A基因表达量是正常肝细胞表达量的1 / 2倍（计算公式 2-△△CT）。


由此可见，若想有效检测一个特定基因的相对表达情况，选择内参进行归一化处理非常重要！


三、如何选择合适的内参？
首先，是内参的获得。常见内参获取的途径有如下三个：

途径一：通过查询相关文献，获取内参。

途径二：通过查询数据库，获取内参。

网址：http://icg.big.ac.cn/index.php/

Homo_sapiens


四、总结
综上所述，在相对定量检测中，最重要的是选择合适的内参基因；而选择合适的内参基因中，最重要的，则是实验内参基因在不同处理间的表达稳定性。选择合适的内参，是相对定量成功的开端！