动物实验

人间宝藏

近年来糖尿病患病率和死亡率明显增加，在我国已成为了继心血管疾病和肿瘤之后位列第三位的多发病和慢性非传染性疾病。在糖尿病患者中，Ⅱ型糖尿病约占 90％以上。Ⅱ型糖尿病主要由胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足引起，构建糖尿病动物模型能够较好地模拟糖尿病的发生与发展过程，有利于揭示糖尿病的发病机制以及治疗药物的筛选，在生物医学和转化医学等领域具有广泛的应用价值。 传统构建Ⅱ型糖尿病动物模型的方法主要包括自发性和诱导性建模，其方法较成熟，操作简单，能更好地模拟Ⅱ型糖尿病的发生与发展过程。利用基因工程技术构建相关基因型的Ⅱ型糖尿病动物模型，有利于从基因和分子水平上阐述人类糖尿病的发病机制。 本文主要介绍不同Ⅱ型糖尿病动物模型的优点、缺点和适用范围，为揭示糖尿病的发病机制及治疗奠定理论基础。 实验动物选择 啮齿类动物(如大鼠、小鼠)的基因组与人类基因组具有较高的同源性，并且关于啮齿类动物基因图谱的研究较为成熟，因此，啮齿类动物常用作动物模型来进行病理机制的研究和药物研发。在具体选择上，由于自发性 2 型糖尿病小鼠如 db/db 小鼠及基因编辑小鼠价格昂贵，而大鼠相对价廉易得；且大剂量的STZ 使用会不可避免的提高小鼠死亡率，故目前国内外倾向用大鼠进行造模。 实验方法 1 诱导型 诱导性Ⅱ型糖尿病动物模型是指通过物理、生物和化学等致病因素，损伤动物胰或胰岛细胞进而导至胰岛素缺乏，或运用各种拮抗剂对抗胰岛素的作用，人工诱导具有Ⅱ型糖尿病特征的动物模型。构建诱导性Ⅱ型糖尿病模型的方法比较简单，造模率较高，目前广泛应用于Ⅱ型糖尿病的研究，但缺点是造模时间较长。 （1）胰腺切除法 胰腺切除法是最早的糖尿病动物模型的构建方法。狗的胰腺被切除后，出现多尿、多饮、多食和严重的糖尿现象。切除胰腺的猪的葡萄糖耐量低于正常，从而可构建糖尿病模型。 （2）膳食诱导法 膳食诱导法是目前较为简单方便的糖尿病动物模型的构建方法，一般利用高糖高脂的饲料连续饲喂实验动物，其原理为糖在体内直接可导至高血糖，在长期高糖膳食诱导下引起糖代谢异常，继而导至Ⅱ型糖尿病，此外，高脂引起的脂代谢异常，进而导至Ⅱ型糖尿病。 （3）化学药物诱导法 STZ STZ 是目前使用最广泛的糖尿病动物模型化学诱导剂，它能对哺乳动物胰岛 β 细胞产生特异性毒性，STZ 主要通过产生自由基损伤 β 细胞的功能，引起胰岛素合成减少，从而诱发糖尿病。为了取得良好的Ⅱ型糖尿病造模效果，STZ 常与胰腺切除法联合使用。通过手术切除实验动物的胰腺钩突及体尾部，然后局部或全身注射 STZ，进而构建胰岛素分泌不足的Ⅱ型糖尿病动物模型。这种方法的优点是克服了切除全部胰所致的其他器官的严重创伤，且避免了大剂量使用 STZ 对其他组织器官的严重损伤。此外，STZ 还可以联合高脂饮食诱导Ⅱ型糖尿病。高脂饲料诱导大鼠 6 ~ 8 周后出现胰岛素抵抗，然后腹腔注射小剂量的STZ，Ⅱ型糖尿病的造模成功率可达 79％。STZ 的剂量受高能饮食喂养时间的影响，高能饮食诱导的时间越长，动物的胰岛素抵抗表现越明显，所需的 STZ 剂量就相应减少，STZ 给药途径或者模型建立的标准不同也会造成所需 STZ 的剂量出现差异。 四氧嘧啶 四氧嘧啶的机理与 STZ 相似，主要通过产生超氧自由基破坏 β 细胞，导至胰岛素合成减少，但与STZ 相比，四氧嘧啶引起的高血糖症具有不稳定性和可逆性。因此，由四氧嘧啶引起的糖尿病模型不足以恰当地评估抗糖尿病药物的降血糖作用。 2 基因工程糖尿病动物模型 Ⅱ型糖尿病是由多个基因表达改变联合环境和遗传因素等共同引起的，而基因工程构建的Ⅱ型糖尿病动物模型具有较高的单基因模拟，因此很难完全模拟临床实际中的Ⅱ型糖尿病的发生与发展过程。 外周组织器官的胰岛素抵抗和胰岛 β 细胞分泌功能障碍是Ⅱ型糖尿病发病过程中的两个重要环节，胰岛素信号转导缺陷是产生胰岛素抵抗和影响胰岛素分泌的重要机制。 胰岛素受体(IR)、 胰岛素受体底物(IRS)、胰岛素样生长因子1受体(IGF1R)是常见的糖尿病相关基因。胰岛素与 IR 结合后可以激活酪氨酸激酶，使 IRS 发生磷酸化，磷酸化的IRS可以激活磷脂酰肌醇-3-激酶 (PI3K) / 蛋白激酶 B(PKB) 信号通路。PKB 一方面可以直接激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR)，另一方面还可以通过结节性硬化复合体 (TSC)间接调控 mTOR 的表达。进而影响糖转运蛋白的合成和降低血糖水平。 研究发现，IR 基因缺失纯合子( IR－ / －) 小鼠在出生不久后会出现代谢紊乱、生长迟缓、轻度胰岛素抵抗、β 细胞增生和高胰岛素血症；IRS－1 基因缺失纯合子(IRS-1－/－)小鼠在成年后出现胰岛素抵抗与 β 细胞增生。类胰岛素生长因子 1 (IGF1)与 IR 具有相似的结构，可通过与 IGF1R 结合来介导类胰岛素效应，IGF1 基因缺失患者表现出严重的胰岛素抵抗与高血糖水平。 瘦素与Ⅱ型糖尿病的发生也有密切关系。瘦素与瘦素受体相结合后，通过两条途径发挥其生理功能。一是作用于下丘脑的代谢调节中枢，抑制食欲、减少能量摄入，即中枢途径。二是影响胰岛素的释放、葡萄糖的吸收及代谢等方面，即外周途径。在外周途径中，瘦素通过Janus 激酶 2(JAK2)依赖性途径激活肝细胞中 AMP 激活的蛋白激酶(AMPK)，并影响 mTOR 信号通路，进而调节葡萄糖转运蛋白的易位和细胞表面水平。 瘦素缺乏或瘦素抵抗能够影响机体脂代谢和糖代谢的过程，从而诱发Ⅱ型糖尿病。此外，转录因子 7 类似物 2基因是迄今为止发现的与Ⅱ型糖尿病相关性最强的基因之一，有调节胰岛素分泌、外周胰岛素抵抗以及维持血糖水平稳定的功能，TCF7L2 基因变异型患者的胰岛素分泌水平降低，更易患Ⅱ型糖尿病。葡萄糖激酶是肝细胞和胰岛 β 细胞中葡萄糖代谢途径中的第一个关键酶，对于血糖稳态的维持具有重要的调节作用。 肿瘤坏死因子受体超家族成员 9 (TNFRSF9) 基因可以通过编码 CD137 影响非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的糖尿病进程，T 细胞在敲除 TNFRSF9 基因后可促进Ⅱ型糖尿病的发展。胰十二指肠同源盒 1 (PDX1)在胰腺发育及 β 细胞功能维持中起重要调控作用，PDX1 基因纯合缺失会导至胰腺发育不全，胰岛素分泌障碍，从而导至糖尿病。ATP 敏感性钾 ( K-ATP)通道的亚基内向整流钾通道(Kir6. 2) 也能够调节胰岛素分泌，当血糖浓度升高时，β 细胞代谢活跃，产生大量 ATP，ATP与 Kir 6. 2 结合后使 K-ATP 通道关闭，引起细胞膜去极化，使电压依赖性的钙离子通道开放，钙离子内流引起胰岛素释放。因此，这些与糖尿病相关的基因常被选择作为基因工程改造的对象，以模拟糖尿病的发生。 造模评价 Ⅱ 型糖尿病动物模型的探索建立已趋于成熟，但仍难以完全模拟人类 T2DM 的发病过程型，目前常用的造模方式优劣不一： 自发模型发病过程与人类有很多相似之处，但其实验动物数量较少，繁殖的条件高、成本高，且没有明确的成模标准； 基因工程模型虽发病机制层面上与人类最为接近，但现仍处于摸索阶段、技术难度大，难以大规模应用； 高脂饲料诱导模型，造模周期长，血糖升高个体差异大，模型较难控制； 单纯化学诱导模型难以造成 2 型糖尿病的主要病理特征——胰岛素抵抗，且成模率不高； 饮食诱导和化学诱导结合可以有效模拟出胰岛素抵抗及胰岛素分泌不足，且造模时间短，是最为普遍的方法。 因此，在研究 II 糖尿病发病机制的过程中，要尽量选择最合适的糖尿病动物模型，如何利用较低的成本在短时间内成功构建Ⅱ型糖尿病动物模型也是以后的研究需要解决的难题。 来源： [1]唐艺丹,王鲜忠,张姣姣.Ⅱ型糖尿病动物模型构建的研究进展[J].中国实验动物学报,2020,28(06):870-876. [2]黄湘宁,姚心怡,谭艳,喻嵘.基于数据挖掘的2型糖尿病动物模型应用分析[J/OL].中国实验方剂学杂志:1-10[2022-10-20].DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.20221511.