重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒 使用说明书 （96T）介绍

SHYaxin

重组羧肽酶B酶联免疫吸附测定试剂盒

使用说明书

（96T）

              

试剂盒用途

该试剂盒用于体外定量检测大肠菌液体中重组羧肽酶B含量。本试剂盒仅供研究或工业生产使用。

试剂盒基本参数

灵敏度 = 1 ng/ml

检测范围：0.25 - 64 ng/ml

特异性：可检测重组羧肽酶B，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。

重复性：板内，板间变异系数均 < 10%。

工作时间：熟练实验人员可在2.5小时内完成一次测定。

有效期：6个月

试剂盒检测原理

本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法（ELISA）定量检测样品中的重组羧肽酶B含量。以抗重组羧肽酶B单克隆抗体包被酶标板，样品或标准品中的重组羧肽酶B与包被抗体结合，加入另一辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗重组羧肽酶B单克隆抗体与上述抗原-抗体复合物结合，以TMB为显色体系，在450 nm波长（参考波长650nm）处测OD450/650 nm值，重组羧肽酶浓度与 OD450/650 nm 值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中重组羧肽酶B的浓度。

试剂盒组成及保存

未拆封的试剂盒可在4℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒，请拆开试剂盒按照下表中的条件分别保存各组分。

说明:

1、所有试剂瓶盖须旋紧以防止蒸发和微生物的污染。

2、酶标板-20℃可存放6个月，4℃存放勿超过一周。

试验所需自备物品

1. 酶标仪（滤光片波长450 nm和650nm）

2.高精度移液器，EP管及一次性吸头

3. 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水

4.吸水纸

待测样品注意事项

1.样品收集后若在1周内进行检测的可保存于4℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃（1个月内检测），或 -80℃（3个月内检测），避免反复冻融。

2.试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果您的样品中检测物浓度高于标准品最高值，请根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。

3.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导至ELISA测值出现偏差。

检测前准备工作

HRP标记抗体应始终置于-20℃保存，请勿室温平衡，随用随取。

1.请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温。提前15分钟打开酶标仪预热。

2.稀释液配制

将浓缩标准品 & 样品稀释液 或 浓缩HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释（1：10）。

3.洗涤液配制

将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1：25）。

提示:从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。请当日使用。

4.标准品配制

将标准品于1000转/分离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0 mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为32ng/ml）, 然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。使用者可以根据实验需要稀释所需的浓度梯度配置。建议配制成以下浓度:  32、 16、 8、 4、 2、 1、0.5 ng/ml。样品稀释液直接作为空白孔0 ng/ml。

倍比稀释方法

取7只EP管，每管中加入500 μL标准品&样品稀释液，从32 ng/ml的标准品工作液中吸取500 μL加入含有500 μL样品稀释液的EP管中混匀配成16 ng/ml的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。

标准品稀释图例（以500 μL为例）

提示：最后一管直接作为空白孔。

5.HRP标记抗体工作液配制

HRP标记抗体应始终置于-20℃保存，请勿室温平衡，随用随取。实验前请先将抗体管低速离心，以避免管壁及管盖上残留抗体。实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟，用抗体稀释液将HRP-标记抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1：125），当日使用。

6.TMB显色工作液配制

实验前计算实验所需用量（以100 μL /孔计算），实际配制时应多配制100-200 μL。使用前15分钟平衡底物和缓冲液，加样前底物稀释液将TMB显色底物稀释为工作浓度（底物：稀释液 =1：20），现用现配。

注：底物加入显色缓冲液混匀后，若观察显色液变蓝切勿加样，说明可能有污染，请更换洁净器皿。

洗涤方法

1. 自动洗板机：每孔加入洗涤液350 μL， 注入和吸出间隔60秒。

2. 手工洗板： 甩尽孔内液体，在洁净厚吸水纸（或干布）上拍干，每孔加入洗涤液350 μL（此处也可以用洁净洗瓶进行冲洗），浸泡5分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。

提示：推荐使用洗瓶冲洗，洗涤液溢出板孔不影响实验结果。若使用排枪，建议每次洗涤更换枪头，加样槽请不要与其他试剂混用，避免污染。

操作步骤

1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔100 μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于37℃孵育60分钟。

提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。浓度由低到高依次加入。

2.洗涤：弃去液体，甩干，在洁净厚吸水纸上拍干。每孔加入洗涤液350 μL，浸泡5分钟，吸去（不可触及板壁）或甩掉板内液体，在洁净厚吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。

3.每孔中加入HRP-抗体工作液100 μL，混匀，酶标板覆膜并置于37℃孵育30分钟。   

4.洗涤：用洗涤液洗板3次，每次洗涤10分钟。

5.每孔加底物显色工作液（TMB）100 μL，酶标板覆膜并置于37℃条件下孵育10分钟。

提示:

1）推荐使用排枪及加样槽加入显色液及终止液，尽量缩小由于加样时差造成的显色差异。

2）根据实际显**况酌情缩短或延长，显色时间在5-30分钟范围内。当标准孔出现明显梯

度时，即可终止。

6.每孔加终止液50 μL，终止反应，室温放置1分钟。

提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪枪头应避免接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。

7.用酶标仪在450 nm波长（参考波长650nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm值）。

提示: 请提前打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。

结果判断

1.计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以标准品的浓度为横坐标（X），OD值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空白组的值）。

2.推荐使用专业的曲线制作软件，如curve expert 1.3或ELISA Calc（请使用Logistic五参数拟合曲线计算方法绘制标准曲线）等。

3.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。

4.典型数据

由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的OD值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。