重组胰蛋白酶细胞消化液的活性测定和抑肽酶对胰蛋白酶的抑制

SHYaxin

胰蛋白酶细胞消化液的活性测定和抑肽酶对胰蛋白酶的抑制

实验目的：

1.测定sigma公司的trypsin-EDTA细胞消化液的活性。

2.用重组抑肽酶抑制trypsin-EDTA细胞消化液中trypsin活性达完全所需的抑肽酶的量。

实验材料：

1) Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml  Lot # SLBN6048V  EXP Aug 17, 0.25%, sterile filtered,BioReagent, suitable for cell culture, 2.5g porcine trypsin and 0.2g EDTA per liter ofHank’s Balanced Salt Solution with phenol red.

2) RTI (recombinant aprotinin) Lot # 160301 ,  5.8 EPU/mg, 21.9mg/ml。

3) 活性测定底物：BAEE溶液，按照公司标准方法配置。

4) 胰蛋白酶活性测定方法，按照公司标准方法操作。

实验过程及结果：

1) 测定trypsin-EDTA solution的活性：4150 BAEE unit/ml,

2) 按照1EPU RTI可抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性，

计算完全抑制4150 BAEE unit/ml胰蛋白酶的RTI用量为 4150/16200=0.256 EPU。

具体实验如下：

2.1.取150ul trypsin-EDTA solution，总活性为622.5 BAEE unit (4150 BAEE unit/ml * 0.15)，

2.2.计算完全抑制，所需加入RTI的体积，622.5/16200=0.0384 EPU，换算为体积为：0.0384/(5.8*21.9)=0.302ul，将RTI稀释10倍后，加入量为3.02 ul。

反应5min后，测定胰蛋白酶活性。

无活性。

结论：完全抑制。

2.3.计算50%抑制所需的加入量为1.51ul。 其他操作同2.2。

反应5min后，测定胰蛋白酶活性。

测定活性：2100BAEE unit/ml。

结论：抑制率为49.39%。

结论：

1）1EPU RTI可完全抑制16200 BAEE unit的胰蛋白酶活性，若不完全抑制，则抑制率与加入的RTI的量成正比。

2）按照胰蛋白酶活性加入RTI (aprotinin)的量。

3）Trypsin-EDTA solution , sigma T4049-100ml  Lot # SLBN6048V的活性为4150 BAEE/ml，

若达到完全抑制，每ml中加入aprotinin的量为0.256 EPU。

加入一半量的aprotinin，可抑制一半的胰蛋白酶活性。