重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书（96T）

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重组胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书（96T）

1.试剂盒用途
本试剂盒用于体外定量检测待测样品中重组胰蛋白酶含量。本试剂盒仅供研究和工业生产使
用。
2.试剂盒基本参数
灵敏度：≤ 1 ng/ml
检测范围：0.078 - 40 ng/ml
特异性：可检测重组胰蛋白酶，与其它重组大肠菌表达系统相关蛋白无明显交叉反应。
重复性：板内，板间变异系数均 < 10%。
工作时间：熟练实验人员可在 2.5 小时内完成一次测定。
有效期：6 个月
3.试剂盒组成及保存
未拆封的试剂盒可在 2-8℃保存一周。如果一周以后才使用试剂盒，请拆开试剂盒按照下表
中的条件分别保存各组分。

说明:
①所有试剂瓶须旋紧瓶盖以防止蒸发和微生物污染。
②酶标板-20℃可存放 6 个月，2-8℃存放勿超过一周。
4.试验所需自备物品
① 酶标仪（滤光片波长 450 nm 和 650nm）
② 高精度移液器，EP 管及一次性吸头，加样槽
③ 37℃恒温箱，双蒸水或去离子水
④ 洁净无纸屑的吸水纸或干布
5.待测样品注意事项
①样品收集后若在 1 周内进行检测的可保存于 2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分
装，冻存于-20℃（1 个月内检测），或 -80℃（3 个月内检测），避免反复冻融。
②试剂盒检测范围不等同于样本的浓度范围，如果样品中检测物浓度高于标准品最高值，请
根据实际情况，做适当倍数稀释后再测。
③.若使用化学裂解液制备的样本或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导至 ELISA 测值出
现偏差。
6.检测前准备工作
①请提前 20 分钟从冰箱中取出试剂盒平衡至室温，观察溶液是否有结晶，如果有结晶按提
示进行操作。提前 15 分钟打开酶标仪预热。
②稀释液配制
将浓缩标准品&样品稀释液&HRP-抗体稀释液用双蒸水稀释（1：25）。
③洗涤液配制
将浓缩洗涤液用双蒸水稀释（1：25）。
提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用 40℃水浴加热使结晶
完全溶解后再配制洗涤液（加热温度不要超过 50℃，使用时洗涤液温度应为室温）。请当
日使用。
④标准品配制
将标准品于 1000 转/分离心 1 分钟后，加入标准品&样品稀释液 1.0 mL 至冻干标准品中，旋
紧管盖，静置 10 分钟后上下颠倒数次，待其充分溶解后，用移液器将其轻轻混匀（浓度为
10 ng/mL）, 然后进行倍比稀释（注：不要直接在反应孔中进行倍比稀释）。建议配制成以
下浓度：10、 5、 2.5、 1.25、 0.63、0.312、0.156、0 ng/mL。标准品&样品稀释液直
接作为空白孔 0 ng/mL。
提示：溶解和稀释标准品过程中尽量避免产生气泡。
倍比稀释方法
取 7 只 EP 管，每管加入 500 μL 标准品&样品稀释液，从 10 ng/mL 的标准品工作液中吸取
500 μL 加入含有 500 μL 标准品&样品稀释液的 EP 管中混匀配成 5 ng/mL 的标准品工作液，
按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。
标准品稀释图例（以 500 μL 为例）

提示：最后一管直接作为空白孔，不再加入标准品工作液。
⑤HRP-抗体工作液配制
实验前请先将抗体管 1000 转/分离心 1 分钟，以避免管壁及管盖上残留抗体。计算实验所
需抗体用量（以 100 μL /孔计算），实际配制时应多配制 100-200 μL 工作液。使用前 15 分
钟，用 HRP-抗体稀释液将浓缩辣根过氧化物酶化抗体稀释为工作浓度（抗体：稀释液 = 1：
250），当日使用。
⑥显色底物（TMB）工作液配制
计算实验所需显色底物用量（以 100 μL /孔计算），实际配制时应多配制 100-200 μL 显色底
物工作液。使用前 15 分钟，用底物稀释液将 TMB 显色底物稀释为工作浓度（底物：稀释液
=1：20），避光保存，当日使用。
提示：配制显色底物（TMB）工作液要严格避免污染，如出现变蓝的现象应重新配制。
7.洗板方法
①自动洗板机：每孔加入洗涤液 350-400 μL（根据加满孔的标准进行调整），注入和吸出间
隔 60 秒。
②手工洗板：甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干，每孔加入洗涤液 350-400
μL（根据加满孔的标准进行调整），浸泡 2-3 分钟，甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸
上拍干。
8.操作步骤
①将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔（复孔），每孔
100 μL。待测样品加入到其他孔，每孔 100 μL，若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样
本稀释液稀释后加样。将酶标板覆膜并置于 37℃孵育 60 分钟。
提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡。
加样时间控制在 10 分钟内。
②洗涤：甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或干布上拍干。每孔加入 350-400 μL（根据
加满孔的标准进行调整）洗涤液，浸泡 2-3 分钟，甩尽孔内液体，在洁净无纸屑的吸水纸或
干布上拍干。重复此洗板步骤 3 次。
③每孔加入 HRP-抗体工作液 100 μL，轻轻晃动酶标板混匀避免产生气泡，将酶标板覆膜并
置于 37℃孵育 30 分钟。
④洗涤：用洗涤液洗板 4 次，方法同步骤 2。
提示：酶标板洗涤不完全可能会造成标准曲线梯度差，或背景值高。应注意加入洗涤液的体
积，以加满酶标板的孔为标准进行调整，确保所有的孔浸泡在洗涤液中并浸泡 2-3 分钟。
⑤显色：每孔加显色底物（TMB）工作液 100 μL，酶标板覆膜置于 37℃ 孵育 10 分钟。

提示: 加显色底物推荐使用排枪和加样槽，但应严格避免底物污染，确保所使用的加样槽洁
净或一次性使用，加液时移液枪的枪头切不要接触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。可
通过观察加样槽中底物是否变蓝预判底物是否被污染。根据实际显**况酌情缩短或延长，
显色时间在 5-30 分钟范围内。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。
⑥终止：每孔加终止液 50 μL，终止反应，室温放置 1 分钟。推荐使用排枪和加样槽。
提示: 终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。加液时移液枪的枪头切不要接
触孔内溶液以避免污染，影响实验结果。
⑦读数：用酶标仪在 450 nm 波长（参考波长 650nm）测量各孔的光密度（OD450/650 nm
值）。
提示: 请提前 15 分钟打开酶标仪电源，预热仪器，设置检测程序。
9.结果判断
①计算每组复孔的平均 OD 值。每个标准品的平均 OD 值减去空白孔的 OD 值作为矫正值。
以标准品的浓度为横坐标（X），OD 值为纵坐标（Y），绘出标准曲线（作图时亦可去掉空
白组的值）。
②推荐使用专业的曲线制作软件，如 curve expert 1.3 或 ELISA Calc（请使用 Logistic 五参数拟
合曲线计算方法绘制标准曲线）等。
③若样品 OD 值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。
④典型数据
由于实验操作条件的不同（如操作者、移液技术、洗板技术和稳定条件等），标准曲线的
OD 值会有所差异。以下数据和曲线仅供参考实验者需根据自己的实验建立标准曲线。