恒温扩增技术是PCR的补充还是代替？？来看看他们的优劣势！

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近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸检测的诊断方法已大量建立并广泛应用于人类疾病的实验室检测中，恒温扩增技术便是其中一种，与其他的核酸扩增技术相比，恒温扩增有快速、高效、特异的优点且无需专用的设备，所以它一经出现就被许多学者认为是一种有可能与PCR媲美的检测方法。

相信以恒温核酸扩增技术为基础的诊断仪器和试剂盒的开发和应用会是未来一，二十年的方向。本文总结了目前常见的恒温核酸扩增技术：LAMP、NERA、NASBA、RCA、HDA、RPA和ERA。同时对PCR和几种恒温核酸扩增技术进行了比较。

为了更好地有选择地开发利用这方面技术，现就这些等温扩增技术的原理、特点及应用进行简要总结。

聚合酶链式反应（PCR）

聚合酶链式反应（PCR）是利用耐高温的DNA聚合酶（Taq 酶），将模板DNA，引物，脱氧核苷三磷酸（dNTP）和缓冲液等在不同温度间循环，从而达到双链DNA分离，引物粘合到模板上的互补区间，最后在DNA聚合酶作用下脱氧核苷三磷酸逐个添加到新合成的DNA链上的过程。

PCR是利用DNA 在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基 互补配对的原则结合，再调温度 至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶 沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

环介导等温扩增 (LAMP )

环介导等温扩增其扩增原理是基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用4种不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3`末端末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。

LAMP的优势：

（1）扩增效率高，能够在1h内有效的扩增1-10拷贝的目的基因，扩增效率是普通PCR的10倍-100倍

（2）反应时间短，特异性强，不需要特殊的设备

LAMP的劣势：

（1）对引物的要求特别高

（2）扩增产物不能用于克隆测序，只能用于判断

（3）由于其敏感性强，特别容易形成气溶胶，造成假阳性影响检测结果

相关产品及应用

LAMP在应用于检测各种病原体的同时，现已逐步用于包括DNA病毒、RNA病毒、细菌和寄生虫等的定性和定量检测，如对新冠病毒、HIV病毒、流感病毒、埃博拉病、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒、副溶血弧菌和日本血吸虫伪蚴等的检测，也可用于转基因食品的检测及动物胚胎性别鉴别等。

切口酶恒温扩增技术（NEAR）

切刻内切酶（NEAR）恒温扩增是目前相关研究最少的一种恒温核酸扩增技术。它是在2008年由Ionian科技公司的研究人员开发并申请专利的（Brain等2009）。Ionian是加州的初创公司，成立于2000年，在2010年被Alere收购。而后Alere在2017年被雅培收购，NEAR成为雅培的专利。

NEAR是一种链置换放大技术，其原理是在核酸切刻内切酶切刻形成的裂口处，通过聚合酶的作用以dNTPs为原料从裂口处的3’端聚合延伸，置换出等位的DNA链，由此又形成了新的完整的含有切刻酶识别位点的DNA序列。这条双链再次被核酸切刻内切酶识别切割，进而开始“聚合-切刻”的循环，产生大量被置换下来的DNA单链，形成指数级扩增。

NERA的优势：

（1） 速度快（最快5分钟可以得到阳性结果）

（2） 灵敏度高（初始只需要数百个病毒拷贝）

（3） 区别于引物设计较复杂的LAMP技术，NEAR技术反应形式多样，可满足不同的扩增需求

（4）反应稳定性好

NEAR的劣势：

（1） 短序列的设计存在高假阳性的可能

（2） 反应机制复杂、产物产量易受扩增模板限制，使得后期扩增从指数增长变为线性增长

（3） NEAR恒温扩增技术的特异性与灵敏度依赖于分子信标引物和Nicking酶，分子信标引物的设计难度大，Nicking酶与其他恒温扩增酶一般都普遍比传统的实时荧光PCR酶要贵，故在检测成本和应用范围等方面，NEAR恒温扩增技术逊于qPCR。

相关产品及应用

被雅培收购的Alere是唯一一家使用NEAR技术开发人类疾病诊断试剂盒及仪器的公司。如图所示，Alere的Influenza A和B的检测试剂盒最快5min检出阳性，7min阳性检出率95%，13min可以确定阴性。另一个关于StrepA的检测试剂盒最快2min检出阳性，3min阳性检出率99%，6min可以确定阴性。这是关于Flu和StrepA最快的分子的检测试剂盒，但ID NOW仪器的通量很小，一次只能检测一个样本。目前的新冠疫情下，实验室的大量检测仍然需要依赖传统高通量qPCR的批量检测，ID NOW无法对于大量样本的检测能力提升带来较大的帮助。而ID NOW属于POCT范畴，在医生办公室、紧急护理诊所和医院急诊科等广泛的医疗场景中都可以进行检测，可以起到一定的市场补充作用。

依赖核酸序列的扩增 (NASBA)

依赖核酸序列的扩增技术 (NASBA)是在PCR基础上发展起来的一种新技术，是由1对带有T7启动子序列的引物引导的连续、等温、基于酶反应的核酸扩增技术，反应在41℃进行，可以在2h左右将模板RNA扩增约109倍，比常规PCR法高1000倍，不需特殊的仪器。

该技术一出现就被用于疾病的快速诊断和病人血清中HIV-1的定量检测。尽管RNA的扩增也可以使用反转录PCR技术（通过反转录形成单链DNA模板),NASBA相比则有自己的优势：可以在相对恒温的条件下进行（一般恒温为41摄氏度）。该技术用于医学诊断，相对传统的PCR技术更为稳定，准确。

NASBA的优势：

（1）它的引物上带有T7启动子序列，而外来双链DNA无T7启动子序列，不可能被扩增，因此该技术具有较高的特异性和灵敏度。

（2）NASBA将反转录过程直接合并到扩增反应中，缩短了反应时间。

NASBA的劣势：

（1）反应成分比较复杂

（2）需要3种酶使得反应成本较高

（3）对DNA病毒的检测上NASBA就显得不是那么适合

相关产品及应用

NASBA作为一项检测技术是十分成熟的，并且已经在国际上受到基础科学和应用科学研究领域的一致认可。目前主要用于RNA的扩增、检测及测序，特别适用于扩增单链RNA，也可用于扩增DNA，已成功地应用于病毒、细菌、寄生虫和细胞因子等的检测。在动物医学方面，已经广泛用于禽流感病毒、新城疫病毒、口蹄疫病毒、狂犬病病毒和产单核细胞李斯特菌的检测和研究中。Biomeriex公司的恒温扩增产品便是采用这种方法设计的。

滚环扩增技术 (RCA)

1998 年建立的滚环扩增 (RCA) 是模拟自然界微生物环状 DNA 的滚环复制过程，发展起来的一种放大信号和靶核酸相结合的检测方法。在具有链置换活性的 DNA 聚合酶作用下由一条引物与环形 DNA 模板的链置换合成，实现环状 DNA 模板的体外等温线性扩增。可分为线性扩增 (单引物 RCA)、指数扩增、多引物扩增和信号扩增RCA。

这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。

RCA的优势：

（1）高灵敏度，RCA有很强的扩增能力，线性RCA的效率可达到105倍，而指数RCA的效率可达到109倍，具有检测单拷贝的潜力。

（2）高序列特异性，可以区分单一位点的不同模式

（3）扩增产物经过磷酸化处理后可直接用来测序

（4）高通量，RCA可以在靶目标上形成闭合的环状序列，确保RCA产生的信号集中在一点，从而实现原位扩增和载片扩增。

RCA的不足：

（1）琐式探针常接近100bp,合成费用较高。

（2）信号检测时存在背景干扰问题

相关产品及应用

RAC在核酸测序、单核苷酸多态性基因分型及细胞原位检测分析、DNA芯片、蛋白质芯片分析等方面都有着广泛的应用前景。目前Qiagen公司和GE Healthcare公司已经用φ29 DNA聚合酶和RCA发展了TempliPhi DNA测序模板扩增试剂盒，可以产生高质量的模板用于DNA测序。在肿瘤的早期核酸检测和监测分析方面也是一个很有潜力的分析工具。

依赖解旋酶 DNA等温扩增技术 (HDA)

依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术 (HDA) 是美国NEB 公司于 2004 年发明的一种新型核酸等温扩增技术。该技术模拟体内 DNA 复制的自然过程，利用解旋酶在恒温下解开 DNA 双链，再由 DNA 单链结合蛋白稳定已解开的单链为引物提供模板，然后在 DNA 聚合酶的作用下合成互补的双链，继而不断重复上述循环扩增过程，最终实现靶序列的指数式增长。

HDA优势：

（1）简单有效，操作简便

（2）不需要昂贵的PCR仪，较细菌学、免疫学和PCR方法更适于在基层实验室推广应用。

HDA的不足：

HDA的研究者较少，发展还不够成熟。

相关产品及应用

研究表明，HDA能够扩增微生物基因组DNA、病原菌DNA、质粒DNA和cDNA等。目前已有HDA应用于腹泻性梭状芽孢杆菌方面的报道。Quidel Corporation的恒温扩增产品便是采用HDA原理设计的。

重组酶聚合酶扩增(RPA)

RPA技术主要依赖于三种酶：能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶、单链DNA结合蛋白(SSB)和链置换DNA聚合酶。这三种酶的混合物在常温下也有活性，最佳反应温度在37°C左右。

常规PCR必须经过变性、退火、延伸三个步骤，而PCR仪本质上就是一个控制温度升降的设备。RPA反应的zui适温度在37℃-42℃之间，无需变性，在常温下即可进行。这无疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要温控设备，RPA可以真正实现便携式的快速核酸检测。

RPA的优点：

①快速检测，在 37-42°C 这一通常最适宜的反应温度下，只需少量核酸分子即可在 3-10 分钟（通常）内扩增至可检出水平，但这将取决于靶标大小。在大部分情况下，只需要一个人即可在半小时内采集样本、制备样本、运行检测并取得结果，并且无需专业培训；

②支持在同一个管中同时进行多个扩增反应。不过，多重化的引物组合需要精心设计，以便每个引物都能同样有效的工作。需要注意的是，RPA反应的引物总量（nmol）最好不要超标太多。如果在一个反应中使用两个以上的扩增引物，就应该控制不同引物的量。另外，检测多个扩增事件的探针、设备以及荧光物质的兼容性都需要提前考虑；

③可定量。扩增子达到可检出水平的时间，依赖于反应起始时的模板量。初始模板的拷贝越多，扩增就越快达到可检出水平。不过，这种定量需要精心的实验安排，确保对照反应是同时开始的。举例来说，可以利用镁离子的添加时间进行控制。因为镁离子一旦进入体系，RPA反应就会开始。此外，较慢的扩增过程有助于更精确的定量。我们可以通过调整反应条件或引物设计来减慢RPA的反应速度；

④25-42℃常温反应，无须热循环，摆脱任何仪器束缚；

⑤可进行荧光终点分析；

⑥引物设计简单，PCR引物设计软件可进行，只要将长度增加到30bp以上，更能保证其特异性；

⑦灵敏度高，能将痕量的核酸模板（1-10拷贝）扩增到可以检出的水平；

⑧特异性高，与qPCR无差异，特别适合微量样品的检测。

RPA的缺点：

①琼脂糖凝胶电泳成像在检测前需要产物纯化；

②没有PCR的热循环来避免引物之间的结合，故恒定温度下反应难以避免部分非特异性扩增。

相关产品及应用

目前，RPA在国际上已有3个公司分别各有1项类似技术，其中主要是被雅培收购的TwistDx的核酸扩增产品。以RPA为基础的TwistAmp® 核酸扩增产品，能够在15分钟内进行常温下的单分子核酸检测该技术对硬件设备的要求很低，特别适合用于体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

酶促重组等温扩增技术（ERA）

酶促重组等温扩增技术（ERA）是苏州先达基因科技有限公司的，具有全球自主知识产权的一种恒温的核酸快速扩增技术，主要依赖能结合单链寡核苷酸引物的重组酶、单链DNA结合蛋白和DNA聚合酶。在温度为37℃~42℃的环境下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时， 在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板 DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。

ERA的优势：

原理与RPA基本相似，因此具备相似的技术优缺点

（1）简单：操作简便，非专业人员亦可完成样本检测；

（2）快速：20分钟内完成检测；

（3）准确：灵敏度可达到10拷贝以下；

（4）便捷：37℃-42℃恒温反应，仪器便于携带，无需精密设备

（5）灵敏度、特异性高

相关产品及应用

苏州先达基因科技有限公司（www.gendx.cn）已经申报了ERA技术专利，其研发的恒温荧光检测仪取代了常规PCR，特别适合在有大量样品的现场检测场所使用。由于RPA和ERA在温度需求上更接近于所谓的等温扩增，也是未来核酸检测方面最有望大力发展和推广应用的等温技术。

ERA技术的产品领域

1、研究诊断领域：

针对细胞培养中的支原体污染，提供一种快速、简单、灵敏的检测方法，只需要20分钟便能得出结果

2、公共卫生领域：

针对危害公众健康的呼吸道传染性病原，肠道致病病原及生殖系统病原进行快速检测

3、食品安全领域：

针对致病微生物、动物源性成分和转基因农产品进行快速现场检测

4、农业生产领域：

针对水产、畜牧养殖和宠物中各类病原，进行早期快速检测和诊断

产品包括：基础型核酸扩增试剂、RT-基础型核酸扩增试剂、荧光型核酸扩增试剂、RT-荧光型核酸扩增试剂、试纸型核酸扩增试剂盒以及RT-试纸型核酸扩增试剂盒。具有可检测性、灵敏性、快速性以及特异性等优点，反应组分已经混合好并冷冻干燥成干粉状态，操作简便，易于保存。

与传统的PCR技术相比，恒温核酸扩增不仅仅是缩短了核酸扩增的时间，更重要的是核酸扩增摆脱了对硬件的束缚，大大减低了价格成本，在基层的推广和现场检测中显示了其非常好的应用前景。

PCR技术原理是利用94℃高温使DNA双链解开，并在耐高温的DNA聚合酶的作用下扩增DNA片段。PCR反应至少需要2个不同的温度使DNA片段得到特异性的扩增。

恒温核酸扩增是利用各种酶与DNA之间的反应使核酸在同一温度下得到扩增。同时由于恒温扩增反应对扩增抑制剂的耐受性大大降低了对DNA模板的纯化的需求 。这些都是恒温核酸扩增技术在分子诊断领域迅猛发展的必要因素。

而另一方面，恒温核酸扩增技术与qPCR技术有着很强的技术互补性，即使恒温核酸扩增技术的年复增长率比qPCR高，但并不能取代后者。qPCR的优势在于中心实验室的高通量测试，而恒温核酸技术更擅长即时快速现场检测。二者的互补性多于竞争性。

未来，我们期待通过更多科研工作者的不断努力，恒温核酸扩增技术可以像PCR一样具备引物设计简单，可以进行多重检测。而且也期待更多以恒温核酸扩增技术为基石诊断试剂盒不断被开发出来。

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苏州先达基因科技有限公司（www.gendx.cn），专注于核酸现场检测，用于独立自主知识产权--酶促恒温扩增技术（ERA技术），在恒定温条件下，7~10分钟即可对痕量靶DNA/RNA特异性区段扩增数亿倍，其低温适应性和灵敏度等方面取得了重大突破并达到国际先进水平，详情可电联18915569557

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