时间分辨荧光免疫分析及其在临床检测中的应用

萝卜涨价了

0引言:标记免疫分析法[1]创立于60年代初期,是将多种标记示踪技术的高度灵敏性和医学免疫学抗原抗体反应的高度特异性相结合的产物,具有极其良好的微量分析效果,现在已广泛应用于疾病诊断、疗效观察和医学科学研究。
发展到目前,标记免疫分析法已包括放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫分析法(EIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)[2][3]。在这几种方法中,由于TRFIA不受样品的自然荧光干扰,具有灵敏度高、特异性强、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽和应用范围广泛等优点,成为继放射免疫分析之后,标记免疫分析法发展的一个新的里程碑,且其灵敏度大大地超过了放射性同位素所能达到的极限(如表1所示),是目前配基结合分析中最有发展前途的一项生化超微量检测手段。本文谨就TRFIA技术原理、检测方法、仪器组成及其临床应用作简要介绍。
1TRFIA的原理时间分辨荧光免疫分析法(Time2ResolvedFluorescenceImmunoassay,简称TRFIA)是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物(代替荧光物质、同位素或酶),标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后,用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,判断反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。
表1几种标记免疫法测量精度







时间分辨荧光免疫分析法之所以能够继放免、酶标、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法,主要取决于它所用标记物的独一无二的物理及化学性质。TRFIA是用镧系元素的三价金属离子及其螯合物作为示踪物,如铕(Eu3+)、铽((Te3+)及钐(Sm3+)、镝(De3+)等,来代替传统的荧光物质、同位素、酶和化学发光物质,标记抗原、抗体、核酸探针等物质。这些稀土离子的螯合物经激发光激发后,能产生特征性的荧光。被激发的荧光有以下两个特点
一是与普通的荧光比较,稀土离子螯合物荧光的衰变时间长,为传统荧光的103～106倍。表2[3]列出了稀土离子及一些常见荧光团的荧光寿命。
二是激发光与发射光的Stokes位移大,可以达到200多nm(如表3[4]所示),而普通荧光物质的Sokes位移最多也只有几十纳米。
利用稀土离子衰变期长的特点,在每个激发光脉冲过后,延缓足够的时间,让短寿命荧光衰变掉后,再打开取样门记录长寿的稀土螯合物的荧光,从而可以最大限度地克服来自样品、试剂的自然本底短寿命荧光(通常为120nS)及散射光的干扰,大大提高检测的灵敏度。其原理示意图如图1。
应用稀土元素作标记物的另一个好处是激发光与发射光峰值Stoke位移大。这表明,在某一波长测定样品荧光时,可以通过非常简单的方法(如使用滤波片或分光计),就可消除激发光和散射光的干扰;同时,被激发的荧光光带极窄,荧光的发射峰非常尖锐,可使仪器调整在极窄的波长范围内测定,极大地降低了来自背景的各种干扰。
再者,标记物体积很小(为原子标记),标记后不会影响被标记物的空间立体结构,这既保证了被检测物质的稳定性(尤其对蛋白质影响更小),又可实现多位点标记。标记物稳定,就可以对标记物进行多次激发,通过对每次激发的荧光信号累加后(如激发测量1000次)取平均值的办法,就可大大减少偶然误差的产生,提高检测的准确度;同时多位点标记技术,不仅使检测更灵敏,也使一个试剂盒能够同时检测出两种或两种以上的项目(如PSA的检测)。
2免疫反应原理和测定过程TRFIA的反应原理和其它标记免疫分析的完全相似。目前已应用的有标记抗原与未标记抗原(待测或标准)竞争抗体的竞争法[5],固相抗原与游离抗原(待测或标准)竞争标记抗体的竞争法和固相双位点夹心的非竞争法[6](如图2)等。竞争法多用于小分子半抗原的测定,非竞争法用来测定蛋白质类大分子化合物。无论何种反应类型,最终形成的抗原—抗体免疫复合物中都结合有镧系离子Eu3+。因为稀土离子作为金属离子,很难直接与抗原或抗体结合,在标记物制备时需要一种有双功能基团的螯合剂,一侧基团与Eu3+连接,另一侧与抗体(抗原)上的自由氨基连接。选择时主要选择标记率高、产物稳定、亲和性强、方法简单、价格便宜的螯合剂。现用于标记的主要有以下几种:N2(P2异硫氰基苄基)2二乙三胺2N1,N2,N32四乙酸(简写N2(P2异硫氰基苄基)2DDTA)、氨基苯基2EDTA、氨基苯基2四氮杂环十二烷四乙酸、异硫氰酸苯甲基2DATT、12(p2苯双氮)2EDTA、二乙烯三胺五乙酸酐(DTPPA)、异硫氰酸苯基2EDTA等。



疫反应后所形成的复合物,在弱碱性缓冲液中经紫外光激发所产生的荧光信号甚弱,这主要是因为水是稀土离子经紫外光激发所产生荧光的淬灭剂。所以要加入一种增强液[7],增强液中非离子型的表面活性剂可以有效地将Eu3+(Β2NTA)3,(TOPO)2复合物形成大分子的微囊,微囊的内侧为疏水性基团能有效地溶解脂溶性的Β2NTA。外层为亲水性基团,可以和水分子结合。这种微囊可最大限度的将能量传递给Eu3+,从而阻断了Β2NTA吸收能量传递给水所产生的淬灭效应。
3时间分辨荧光免疫分析仪时间分辨荧光分析仪是检测镧系离子荧光信号的必备仪器。其基本原理是依据不同荧光发射体所产生荧光寿命的不同而设计的,主要有三大部分组成[2][5][9](图3):
3.1光源根据TRFIA的原理,激发光应具有如下特点:
脉宽小(2倍的脉宽加上非特异荧光的衰变时间,应小于延缓时间);
能量高在三价稀土离子激发光波长处(紫外波段)有足够的能量,以提供样品的饱和激发。
基于这些要求,目前比较合适的光源有
高频脉冲氙灯(频率≥1000Hz,脉宽≤10Λs),它的优点是体积小、工作稳定、寿命长、使用方便;缺点是激发能量低,限制了分辨极限(可分辨10-17molˆml),并且还需要一组聚焦透镜及滤光片光学系统,增加了系统的复杂性;
高能量的激光器如氦镉离子激光器[8]、e2Cd激光器、大能量的N2激光器、小型封闭式N2激光器[3][9]等。例如小型封闭式N2激光器[10],它的输出脉冲波长337nm,光脉冲宽度为10ns,光脉冲重复频率15Hz～20Hz。使用激光器的好处是激光单色性好、脉宽小、峰值功率高,可以改善信噪比,提高检测的灵敏度,使最小检出限可达10-19molˆml;缺点是体积大,寿命短,每秒内的光脉冲数少。



3.2荧光信号获取系统
包括样品室、光电倍增管、放大器、甄别器、积分器、AˆD信号转换器和线路。各部分的工作状态由单片机控制。
单片机接收到开始的信号,便触发脉冲发光器,激发样品池里的待测样品发出荧光;样品的荧光信号,经一窄带滤光片作光谱分离后,进入光电倍增管,转变为电信号;PMT的信号,经放大器放大后,进入检波器,检波器将样品的1000次信号经比较进入积分器;积分器的取样时间根据所用示踪剂的不同可以调节。如用Eu3+作示踪剂时,一般延迟时间为200Λs,积分器门宽400Λs,恢复时间400Λs,共1ms。每个样品激发1000次,这1000次的荧光信号,经放大器送入积分器累加,然后送入AˆD转换器转换成数字信号,再送入微型计算机存储处理。
3.3数据处理系统以微电脑为中心,按预先编制的程序,先由标准品的荧光值,选择合理的曲线拟和方式,作出标准曲线,再将待测样品的荧光信号与标准曲线比较,得出待测物浓度,并将数值存入微机、打印输出。4TRFIA在临床免疫检测和科研上的应用TRFIA技术在国外已被广泛应用于临床检测,其新的应用也不断被开发出来[11～27],如免疫组织化学、微阵列[28]等,并可用于双标记[29,30,31]、三标记[32]和四标记[33]等多标记物的免疫分析。在国内,这项技术也正逐步得到重视,并已有商品化的试剂推出,且种类已多达八十多种,其中在临床检验中广泛应用的项目有:
分泌科检查甲状腺系列:T3、T4、FT3、FT4、TSH、UltraTSH、TBG、TG
糖尿病系列:Insulin、C2Peptie
生长激素类:Hgh其他:Cortisol
肝炎系列:甲肝、乙肝、丙肝HBsAg3、HB2sAb3、HBeAg3、HBeAb3、HBcAb3、HCV3、HIV3
妇产科检查FSH、LH、hCG、ProlactinE2、E3、Testos2terone、Progesterone、SHBG
瘤科检查AFP、CEA、CA250、PSA、hTG、Β22Micro、NSE、PAP、CA2242、PSA(FreeˆTotal)、PSAEQM、CA250、CA2125、CA2199、CA2153、CA2724、CY2211
遗传科检查:产前筛查:hAFPˆΒhCG、PAPPA
新生儿筛查:Neo2TSH、Neo2T4、Neo2IRT、Neo217Α2OHProg、PKU核酸探针及基因杂交检测,多标记定量PCR检测
血液科检测贫血检查:Ferritin、VitB12、Folicacid白血病:免疫细胞分型等
细胞学检查细胞毒实验、细胞质及组织化学分析、酶类检测及细胞受体检测(包括MHC、HLA等多种检测项目)
(7)科研核酸探针及基因杂交检测:多标记定量PCR检测、单标记检测、双标记检测、四标记检测,包括过敏原、细胞因子、传染病、药物检测等范围的一千余种项目。6结论TRFIA技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身:灵敏度高、特异性强、稳定性好,且测定范围更宽,试剂盒货架寿命长,操作简便和非放射性等特点,非常适用于生物学、医学上的超微量分析,是一项很有前途的、值得推广的技术。
体外诊断技术交流群：546848508

德晟仔

厉害，这个很专业