直接免疫荧光法病毒抗原测定在呼吸道感染性疾病诊断中的应用

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上呼吸道的感染大多是由病毒感染所引起，特别是在儿童、青少年阶段，病毒感染较为频繁¨J。随着2003年SARS病毒的大肆传染和2009年甲型流感的爆发至今，我们越来越意识到呼吸道病毒检测的重要性。目前，呼吸道病毒检测的方法有很多，但都存在着各种各样的不足，难以在临床检查中推广。多数医疗机构对于呼吸道感染很少进行病原学检测，特别是病毒的检测，而是直接使用抗菌药物进行治疗，从而造成了抗菌药物的滥用，不但延误了病毒性疾病的诊治，而且无形中增加了患者的医疗负担。为了解呼吸道感染中病毒感染的情况，我们采用直接免疫荧光法检测了呼吸道感染患者7种病毒抗原[包括呼吸道合胞病毒(RSV)、腺病毒(ADV)、流感病毒A(InfA)、流感病毒B(InfB)和副流感病毒1、2、3型(PIV1、2、3)]。

材料和方法标本来源

2010年12月至2011年5月在常州市第二人民医院住院的呼吸道感染患者762例，其中成人38例(男25例，女13例，年龄21～83岁)、儿童724例(男439例，女285例，年龄1d～17岁)。

二、试剂与设备

1．检测试剂

呼吸道病毒抗原检测试剂盒[美国DiagnosticHybrids公司，已通过美国药品食品监督管理局(FDA)认证用于体外诊断]，包括单克隆荧光标记的7种抗体(RSV、ADV、InfA、InfB以及PIV1、2、3)，浓缩洗涤液磷酸盐缓冲液(PBS，40×)，封闭液，抗原对照玻片，另外需配备冷丙酮。

2．检测设备

荧光显微镜，37水浴箱，涡旋振荡器等。3．检测材料绒植拭子、载玻片、盖玻片等。

三、方法

1．标本的采集将配套的绒植拭子经鼻腔插人到达鼻咽部约7～8cm。来回旋转2～3次后迅速抽出拭子，放人加有3mLPBS(10×)的塑料试管中，盖上盖子送检。

2．标本处理将绒植拭子标本在漩涡混匀器上轻微混匀3下(约30S)，见浑浊后去掉绒植拭子。以700×g离心10rain。弃去上清液(留约100～150IxL)，吸管吹打混匀，形成混浊细胞悬浮液。

3．标本制片标本点样在载玻片上(约10～l5L)，电吹风机冷风下风干10～15min至干燥，浸没在冷丙酮中固定10min，取出晾干。

4．标本反应每份标本分别加D3试剂1滴(25)，必须完全覆盖待测标本。将载玻片放在湿盒中置于37培养箱(或放在泡沫上置于37水浴箱)孵育15～30min。载玻片用PBS冲洗1次，后浸没在PBS中洗2次(PBS不能重复使用)。

5．标本观察玻片中央加1滴封闭液，盖上盖玻片。

四、统计学方法

用SPSS17．0软件进行检验，P<0．05表示差异有统计学意义。

结果

一、阳性结果荧光显微镜下显示苹果绿荧光的细胞为阳性细胞，而被Evans蓝染成红色的细胞为阴性细胞。当放大倍数为200倍时，在视野中找到≥2个阳性细胞判为标本阳性。见图1、图2。

二、7种病毒的阳性检出率在762例患者中，阳性例数为264例，阳性检出率为34．65％。其中阳性率最高的是RSV(70．45％)，其次为PIV3(10．98％)。见表1。

三、不同季节呼吸道病毒感染情况分析经检验，不同季节呼吸道病毒的感染率不同(P<0。05)。由于本研究标本在12月～5月问采取，经历了冬季、春季。随着气温的升高，病毒的检出率逐渐降低，冬季要明显高于春季。另外，虽然随着气候变暖，RSV的检出率降低，但在7种病毒中仍占主要地位；PIV3检出率增加的幅度较大。见表2

四、18岁以下不同年龄组患儿呼吸道病毒的感染情况经检验，不同年龄组患儿的感染率不同(P<0．05)，其中6个月以内婴儿的感染率较高，之后随年龄的增长而逐渐降低。由于成人标本数较少，因此不做此方面的统计。见表3。

五、儿科常见临床诊断与病毒感染的情况从构成比看，呼吸道病毒感染在喘息性支气管肺炎、毛细支气管炎、支气管肺炎和一般肺炎较高，其检测例数也比较多。毛细支气管炎的阳性检出率最高，达64．21％，其次为喘息性支气管肺炎，占45．9l％。见表4。

讨论

病原学检测对于呼吸道感染的诊断和治疗极为重要，有文献指出95％的上呼吸道感染和大部分的下呼吸道感染是由细菌以外的病原体引起，其中病毒最为常见。因此进行早期快速的呼吸道病毒检测十分必要。有研究证明呼吸道病毒抗原检测阳性结果的患者接受抗菌药物治疗的时间明显缩短，这样即可以减少抗菌药物的使用，又使住院时间缩短。

对于呼吸道病毒的检测，目前主要的方法有分离培养鉴定、核酸检测以及抗原抗体的检测。FDA认为，病毒感染需用免疫荧光检测、病毒培养或聚合酶链反应(PCR)来确认，原因是其他方法的阴性结果无法排除流感病毒感染。就现有检测方法来看各有优劣，分离培养虽是金标法，但此方法耗时较长，不利于早期指导临床治疗；PCR虽然敏感性高，但其对实验室的要求高，成本也高，难以普及。抗体的检测目前应用较广，但由于IgM抗体一般是在呼吸道病毒感染6d以后才能检测到，IgG抗体一般在治疗后才会出现，检测周期长，临床应用不便J。相比较之下直接免疫荧光法抗原检测更为简便、快速且检测成本较低，利于普及。

在本研究检测的患者中，儿童占95．01％。而在所有感染者中，以RSV感染最为多见，占阳性病例的70．45％，此结果与国内外的报道一致。不同年龄组患者的感染率也有所差异，有文献指出，3岁以内儿童的阳性检出率较3岁以上儿童高2．4倍之多，因此对于此年龄段儿童呼吸道病毒感染的确诊较为重要9。本研究对3岁以内患儿进行继续分析，6个月以内的婴儿感染率较高，达44．18％，可能与这个时期婴幼儿免疫功能低下有关，因此对6个月以内的患儿要重点关注。

另外，从儿科常见临床诊断与病毒检测的结果来看，毛细支气管炎、喘息性支气管肺炎阳性检出率较高，而且多数患者在检测呼吸道病毒感染之后使用了抗病毒的药物进行治疗，病情得到及时的控制。因此，当患者做此诊断时，是否为呼吸道病毒感染可作为首先考虑的方向之一。成人下呼吸道病毒感染极易被忽视。本研究有1例患者因肺间质纤维化入院，住院期间受凉合并肺炎，经抗菌药物治疗数日未见好转，后进行病毒抗原检测，为InfA阳性，改用抗病毒药物治疗后痊愈。有研究表明下呼吸道感染患者病毒检测阳性率远远高于健康人，提示对住院下呼吸道感染患者有必要开展呼吸道病毒的常规检测¨。本研究结果表明，不同的季节呼吸道病毒感染的情况也不同，冬季明显高于春季。春季阳性检出率为25．45％，而冬季阳性检出率高达44．23％。冬春两季RSV的检出率均最高，但除RSV以外的6种病毒中，InfA在冬季的阳性检出率较高，而在春季PIV3的阳性检出率较高，提示在冬季初春病毒感染的高发时节，要侧重于RSV以及InfA感染的防治。随着气温升高，RSV的检出率逐渐降低，PIV3的检出率逐渐升高。综上所述，直接免疫荧光法病毒抗原测定简单、快速、实用，不但可用于呼吸道感染病毒病原体的早期快速诊断，还可用于各季节病毒流行的动态监测。

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