免疫荧光检测技术及其在寄生虫检测中的应用进展

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免疫荧光技术始于20世纪4O年代。Coons(1941)最先使用异氰酸荧光素标记抗体检测小鼠肺炎球菌多糖抗原，在紫外显微镜下观察，发现了抗原在组织内的分布，并率先提出了用免疫荧光技术检查组织内抗原的方法，但由于非特异性荧光干扰及荧光素在合成和质量上存在问题，未能得到广泛应用。Riggs等(1958)合成了异硫氰酸荧光素(FITC)，这一新的荧光素有性质稳定(可与目标蛋白稳定结合)且不易产生毒性等优点。为了排除非特异性荧光信号干扰，Glodstein等用凝胶过滤层析技术进行抗体提纯，使免疫荧光技术更加简化。最初的免疫荧光技术主要用于鉴定组织细胞中功能蛋白的确切位置，现在的免疫荧光技术已成为医学诊断、兽医学研究和临床快速诊断中不可缺少的重要手段。
I免疫荧光技术1．1技术原理免疫荧光技术是在组织化学及蛋白质技术基础上发展起来的一项新技术，是免疫学技术和荧光染色法结合在一起的新方法。具体来说，免疫荧光技术也是一种血清学反应，其原理与普通血清学反应基本相同。该技术是用已标记了荧光素的荧光抗体(抗原)作为探针检查组织或细胞内相应的抗原(抗体)，在组织或细胞中所形成的抗原一抗体复合物上沉着有荧光素，在荧光显微镜下观察样品，荧光素受激发光的照射而发出荧光，通过荧光所在的细胞或组织，实现对抗原或抗体的定位，同时还可利用定量技术对样本进行定量。荧光素既能标记抗体，也能标记抗原，但由于抗原结构和理化性质较复杂，荧光素标记的条件不易控制，通常用荧光素标记抗体，因此也称为荧光抗体技术。


1．2常用的荧光色素
1．2．1有机小分子染料有机染料多为含有多环芳烃的有机分子，是目前应用最为普遍的荧光素。异硫氰酸荧光素(FITC)，是目前应用最为广泛的荧光素，是通过异硫氰基与蛋白质中氨基酸(主要为赖氨酸)的氨基结合而发出黄绿色荧光；丽丝胺罗丹明呈桔红色荧光，荧光效能较低，一般不单独使用，通常用作FITC标记抗体的反衬染色或双标记配合使用；四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)和藻红蛋白(R—RE)，均呈橙红色荧光，也作为FITC的配合染料使用；四乙基罗丹明(RB200)，呈橘红色荧光，在荧光染色中并不常用。这类荧光染料光稳定性较差，发射峰与最大吸收峰之差(Stokes位移)仅为30nm，激发光谱和发射光谱峰间有重叠而产生相互干扰，不利于多参数同时分析，Santra等(2004)用二氧化硅包埋荧光染料，Stokes位移扩大至290nm，光稳定性也得到了很大的改善，成功地检测了人肺腺癌和大鼠大脑组织。
1．2．2半导体量子点半导体量子点是一类新的可用于生物标记的荧光素，在半导体材料上包覆一层稳定性更高的物质(如氧化硅)，其优点是光稳定性和发光性能强，其荧光寿命可达有机染料分子的100倍以上，并且可以使用小于其发射波长10nm的任意波长的激发光进行激发，故使多个参数的共同评价成为可能；这类荧光材料具有广阔应用的前景，吸弓I了很多研究者的关注。Ku等(2011)用量子点阵直接标记感染疟原虫的红细胞，发现这种新的检测手段可提高抗寄生虫药物敏感性。
1．2．3稀土离子配合物稀土离子配合物主要是铕(Eu)和铽(Tb)离子的配合物。以钒酸盐(YVO)为基质的纳米稀土发光材料是最具有研究意义及应用价值的稀土荧光材料，掺杂矾酸盐的稀土离子配合物由于其固态的微环境，保证了其稳定性，避免了溶剂分子对荧光的淬灭，在紫外光下具有很好的发光性能。随着纳米科学技术的发展，这一荧光材料有望成为新的免疫荧光标记体。
1．3技术特点1．3．1可靠免疫荧光技术是利用相应抗原抗体的特异性反应而设计的，它将荧光素标记的抗体作为一种试剂，在特定的条件下与抗原反应，在紫外光或蓝紫光照射下，抗原存在部位就会发出特异荧光，这样检验出的抗原必然是与抗体相对应的抗原，也就提高了结果的可靠性。
1．3．2快速免疫荧光检测技术是建立在血清学反应的第一阶段(抗原一抗体结合)上，所以试验时间较一般血清学方法大大缩短，按常规操作1～2h即可完成；这对传染病的快速诊断具有非常重要的意义。
1．3．3灵敏作为一种特殊的染色技术，免疫荧光技术灵敏度很高，非一般血清学方法所能及。只要是在显微镜下可辨别的样品，无论数量多少，通常都可以检测，如用荧光抗体方法可以检测出0．8×10／Lg／mm的肺炎球菌荚膜多糖体。
1．3．4广适性原则上免疫荧光检测法可用于一切抗原抗体反应，既能检测抗原，也可检测抗体，体内外均适用，与一般的血清学方法相比，免疫荧光技术可在细胞水平上对特异性抗原或抗体进行定位。
2免疫荧光技术分类及其在寄生虫检测中的应用免疫荧光技术作为一种成熟的方法，已建立了多种检测方法。在寄生虫学领域里，该技术作为一种血清学方法可用于寄生虫病的诊断、流行病学调查和治疗后的复查，许多人体寄生虫病(如血吸虫病、肺吸虫病和弓浆虫病等)均已用免疫荧光方法进行诊断。
2．1间接免疫荧光技术(indirectfluorescentanti—body，IFA)该方法是应用最广的免疫荧光技术，是用特异性的抗体与切片抗原结合后，再滴加荧光素化的第二抗体，在荧光显微镜下观察结果。由于本法所用的第二抗体较多，因而只需满足种属特异性，即可用于多种第一抗体的标记检测。IFA法为OIE规定的弓形虫(Toxoplasmagondii，T0X)检测的“金标准”。IgM是体液免疫中出现最早的抗体，免疫荧光技术可以更敏感地检测出早期弓形虫IgM(VanLoon，1983)，其他方法则需要同时检测IgG和IgM来判定结果(Sucilathangam等，2010)。隐孢子虫和贾弟鞭毛虫俗称“两虫”，是饮用水和再生水的必检对象，且与艾滋病的发生有关(张龙现，2011)，国际上通常采用美国国家环保局(USEPA)1623法(Feng等，2011)对“两虫”进行检测。Thad—deus(2004)对比了IFA法和DFA法检测隐孢子虫，敏感性均为100％，而且不同种的隐孢子虫用这种方法检测具有相似的特异性，因此在常规条件下应用IFA法和DFA法检测隐孢子虫都具有较高的可行性，且检测成本远低于EPA1623法，大大降低了检测成本。Sadan首先用免疫荧光法诊断人体血吸虫病。血吸虫皮层吸附有宿主抗原，在检测前必须用氯化钙溶液处理血吸虫整虫(Kanamura等，2002)，目前正研究用干燥脱皮冰冻成虫或脱皮后虫体碎片作为切片抗原，克服了仅能用新鲜虫体检测的局限性。免疫荧光法是检测肺吸虫常用方法之一，应用肺吸虫成虫石蜡切片这一方法制备的抗原可长期保存，进一步提高了免疫荧光法的实用价值。陈静卿(1982)将肺吸虫IFA法与酶标吸附试验和问接血凝试验相比较，IFA法抗体用量少，更容易掌握。Lee等(2011)应用IFA法检测人体血液中疟原虫特异性抗体，结果表明，IFA法不仅可检测阳性病人，还可以检测隐性感染患者，是疟原虫最为敏感的检测方法，且被应用到怀孕妇女疟原虫早期诊断中(Hassan等，2011)。
2．2直接免疫荧光技术(directfluorescentanti～body，DFA)该方法是最早的免疫荧光技术，是用已标记了荧光素的特异性荧光抗体直接滴在含有相应抗原的载玻片上进行孵育，在荧光显微镜下观察检查结果。由于该方法检测敏感性低，且每检查一种抗原都需要制备其特异的荧光抗体，应用并不广泛。Bickley(1989)将DFA法与吖啶橙染色法、悬滴法及直接培养法检测阴道滴虫效果进行了比较，检测结果均表明DFA检’坝4法最为敏感。利什曼原虫的动基体为浓缩的dsDNA(董荩，1986)，是一种理想的抗原基质，Francis(2002)对比了Westerblotting、ELISA和DFA3种方法对利什曼原虫的检测，其中DFA法是最为敏感的检测方法。在“两虫”的免疫荧光检测研究中，DFA法已十分成熟，并且已制备了商品化试剂盒出售(Xiao等，1993)，Ro—na(2011)应用该试剂盒对鱼体内分离的两虫卵囊进行检测，不仅检测快速，还可以作为组织学检测的旁据。水生动物寄生虫免疫学检测方法并不成熟，目前OIE仅能以组织学检测作为水生动物寄生虫检测的“金标准”(Park等，2010)，但这些方法不能满足目前快速、敏感的检测需求，并且虫体不易提取和纯化，故制备表面抗原进行分离纯化是很必要的，中国检验检疫科学研究院动物检疫研究所正研究应用DFA法对水生动物寄生虫进行检测。
2．3时间分辨荧光免疫分析法(time—resolvedflu—oroimmunoassay，TRFIA)该方法是同位素免疫分析技术，是用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，测量波长和时间两个参数进行信号分辨，该法可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。Kapel首先用夹心法TRFIA检测抗隐孢子虫粪抗体，结果表明重复性与特异性均好。周彬(2009)用TRFIA法建立的弓形虫IgG定量检测方法，采用了稳定的稀土离子标记和增强液的放大效应，通过方法学鉴定表明，TRFIA法在灵敏度、准确性、特异性等方面均达到临床诊断的要求，并可在基层实验室推广。
2．4补体法该方法是间接染色法的一种改良法，最早由Goldwasser建立(肖俊杰，2010)，是将抗原和抗体及补体三者结合为复合物后，再与荧光素标记的抗补体进行反应，四者形成复合物，在荧光显微镜下观察结果。补体法不但有与间接法相同的优点，而且只需要一种标记抗补体抗体，就可实现各种抗原抗体系统的检测。该法虽敏感，但参加反应的因素较多，故特异性差，目前并无相关应用方面的报道。
3免疫荧光法的限制与前景免疫荧光技术是把免疫学技术、荧光染色技术和显微镜观察方法结合起来的一种复合型技术。在兽医临床中，这一技术不论在疾病诊断还是治疗方面都得了广泛的研究。在寄生虫学领域里，国内外的相关应用十分广泛，许多寄生虫病均已成功应用免疫荧光方法进行检测和诊断。免疫荧光技术与其他检测方法相比，有优点也有不足，它可以在细胞水平上对特异性抗原(抗体)进行定位，目前也已将这一技术进行定量化、标准化和自动化。但目前所使用的荧光素在光稳定性和光漂白现象方面存在着较严重的问题，因此，寻找新的荧光物质，克服现有荧光抗体标记存在的问题，以提高检测结果的可信性。
总之，随着免疫学技术的不断研究和进步，免疫荧光技术会不断地完善。在不久的将来，免疫荧光技术在兽医临床中进行抗原的定位、疾病的快速诊断及病原微生物、寄生虫的鉴定中将发挥自身特有的作用。