乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂性能评价要点

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乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是一个严重的公共卫生问题。全球每年约有1【)()万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌(肝癌)，肝癌患者巾，75以上由HBV所致。我国属HBV感染地方性流行区。根据2006年全国乙型肝炎流行病学调查，我国现有的慢性HBV感染者约9300万人，其中慢性乙型肝炎患者约2000万例，每年因HBV导至的肝硬化和肝癌死亡约3o余万例，新发乙型肝炎病例约50～1O0万例。乙肝防治是当前及今后相当长时间内要面临的重要任务。

HBV是血源传播性疾病，主要经血(如不安全注射等)、母婴及性接触传播。乙型肝炎病毒属嗜肝DNA病毒科(hepadnavdae)，基因组长约3．2kb，为部分双链环状DNA。急性乙型肝炎病毒感染HBVDNA存在先阳性后消失的发展过程，慢性乙型肝炎病毒感染的自然史一般可分为4个期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动或低(非)复制期和再活动期，其中免疫耐受期HBVDNA滴度较高(3v于20000IU·mU)，免疫清除期表现为血清HBVDNA滴度大于2000IU·mL，但一般低于免疫耐受期。非活动或低(非)复制期可表现为HBVDNA持续低于最低检测限。部分再活动期患者表现为HBVDNA活动性复制。但并不是所有HBV感染者都经历以上四期]。

本文所指乙肝病毒核酸定量检测试剂是指利用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)方法，以乙肝病毒基因序列为检测目的，对人血清、血浆中的乙肝病毒DNA进行体外定量检测的试剂。本文结合现行法规及该试剂自身特点详述了其性能评价的要点，为试剂研发和注册申报提供参考。

1各级标准品的建立

采用灭活病毒的血清／血浆建立标准品，通过逐级标化，建立校准品和质控品。制备的企业标准品、二级标准品、用于制备商品化校准品的储备液以及不同基因型的阳性样本均应能够溯源至国际标准品／国家标准品。逐级标化过程一般包括以国际标准品／国家标准品为校准品建立标准曲线对企业标准品进行赋值，以赋值后企业标准品为校准品对企业二级标准品进行赋值，然后逐级对制备商品化校准品的储备液以及质控品进行赋值，建立完整的溯源链。

2分析性能研究的主要内容2．1核酸提取方法的提取效率验证

临床标本中可能含有各种PCR抑制物，因此，对于DNA提取试剂的选择，除最大量释放出目的DNA外，还应包含核酸纯化步骤，尽可能去除PCR抑制物及干扰物质。应对核酸提取纯化方法的回收率进行验证，或通过检测已赋值样本的相对回收率对提取效果进行考察，同时考察前处理方法与后续步骤的适用性lg。

2．2灵敏度研究

灵敏度分析包含两方面的内容：最低检出量和定量限。最低检出量为具有95以上阳性检出率的病毒水平，定量限为能够符合准确度要求的最低病毒水平。

使用国际标准品／国家标准品进行梯度稀释并多次检测确定最低检出限。将多次(至少1O次)钡0量的符合试剂准确度要求的最低病毒水平作为最低定量限。应用最低检出限或接近最低检出限的病毒浓度的不同基因型(至少包括国内基因型中的B、C、D型)对最低检出限和定量限进行验证。

2．3线性范围研究

线性范围确定的研究应使用高值临床样本(由可溯源至国家标准品／国际标准品的方法定量)进行梯度稀释，稀释剂应使用经确认为阴性的混合人血清或血浆，应包含不少于9个浓度(应包含接近最低检测限的临界值浓度)，使用至少3个批次的试剂进行试验。通过评价一定范围内的线性关系及各水平的准确度确定该方法的线性范围。

2．4准确度研究

对测量准确度的评价应进行与国家标准品(和／或国际标准品)的比对研究、回收试验、方法学比对等试验研究。

2．4．1与国家(国际)标准品的比对研究

使用国家(国际)标准品进行验证，考察与相应标准品检测结果的符合情况。

2．4．2回收试验

用于评估定量检测方法准确测定加入纯分析物的能力，结果用回收率表示。回收试验应对检测范围内的高中低值标准品进行检测，计算各水平的相对回收率。

2．4．3与同类试剂的比对研究

采用国内或国际普遍认为性能较好的同类试剂作为比对试剂，被考核试剂与比对试剂同时检测一批病人样品，从测定结果间的相关性了解试剂间的一致情况。

2．5精密度研究

测量精密度的前提是必须保证研究的科学合理性。应对每项精密度指标的评价标准做出合理要求，如标准差或变异系数的范围等。

2．5．1对可能影响检测精密度的主要变量进行验证，除试剂(包括提取组分和PcR组分)本身的影响外，还应对PCR分析仪、操作者、地点等要素进行相关的验证。

2．5．2合理的精密度评价周期，例如：为期至少2O天的连续检测，每天至少由2人完成不少于2次的完整检测，从而对批内／批间、日内／日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。如有条件，应选择不同的实验试进行重复试验以对室间精密度进行评价。

2．5．3用于精密度评价的质控品应至少包括四个水平

2．5．3．1阴性质控品：不含HBVDNA的质控品，不得检出阳性(72≥2o)。

2．5．3．2临界阳性质控品：待测物浓度略高于试剂盒的最低检测限，阳性检出率应高于959／6(≥2o)。

2．5．3．3弱阳性质控品：待测物浓度呈弱阳性(高于定量限浓度1个数量级)，阳性检出率为100％且变异系数(CV)符合标准要求(n≥20)。

2．s．3．4强阳性质控品：待测物浓度呈中度至强阳性，阳性检…率为100且变异系数(CV)符合标准要求(”≥2O)。

2．6HBV不同基因型的覆盖

应对乙肝病毒不同基因型(至少包括B、C、D型)进行检测，重点考察各基因型病毒样本的最低检测限、准确性及精密度指标；每个基因型的病毒样本稀释成至少3个浓度水平，对每水平样本进行重复测定。考察每种基因型样本的准确度和精密度。

2．7分析特异性

2．7．1交叉反应

2．7．1．1用于乙肝病毒核酸检测试剂交叉反应验证的病原体种类主要考虑以下几方面可能性：核酸序列具有同源性、易引起相同或相似的临床症状以及临床较为常见。如人巨细胞病毒、E-B病毒、人类免疫缺陷病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、梅毒、人类疱疹病毒6型、白色念珠菌(CA)、单纯疱疹病毒2型、单纯疱疹病毒1型、甲型流感病毒、痤疮丙酸杆菌(PA)、金黄色葡萄球菌(SA)等。

2．7．1．2建议在病毒和细菌感染的医学相关水平进行交叉反应的验证。通常，细菌感染的水平为10。cfu·mU或更高，病毒为10pfu·1hE-或更高。

2．7．2干扰物质

2．7．2．1潜在的干扰物质主要包括：内源性物质(如人白蛋白、抗核抗体、游离血红蛋白、甘油三酯、自身抗体、胆红素、总IgG等)和常用的治疗药物如普通IFNa(2a、2b和lb)和聚乙二醇干扰素(2a和2b)[PegIFNc~(2a和2b)]、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定等。

2．7．2．2使用医学相关水平的干扰物浓度进行验证，建议在每种干扰物质的潜在最大浓度(“最差条件”)条件下进行评价。对于常见药物干扰试验，建议参照相应药物药代动力学研究确定的治疗药物浓度添加相应药物进行干扰验证。

2．7．2．3建议在病毒的检测临界值水平对每种干扰物质的干扰影响进行检测。

2．8溯源性

使用国家标准品／国际标准品为定标品，应用多台仪器对企业一级定标品进行定标，以下逐级对企业二级标准品、定标储备液、阳性参考品(质控)进行定标。

2．9应注意的其他问题

对于适用多个机型的产品，应对所有型号仪器分别进行性能评估。如适用于不同样本类型，应提交对不同样本类型一致性的验证，包括不同抗凝齐、采血管的验证。

对试剂分析性能的充分验证是保证试剂临床应用灵敏、准确、特异的前提，是了解试剂性能的必经步骤，因此大量的试验、多批次的验证是必要的。对于不同试剂，其分析性能研究方法应根据试剂本身特性进行设计，本文阐述的乙肝核酸定量检测试剂的性能评价应首先考虑病毒本身的特性及试剂的临床用途，因此定量是否灵敏、是否准确精密、是否能够涵盖常见基因型、是否具备良好的特异性以及是否易被常见干扰物质影响等方面成为其分析性能考察的重点。