免疫胶体金技术及其发展前景

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免疫胶体金技术是 80年代继三大标记技术（荧光 素、放射性同位素和酶）后发展起来的固相标记免疫测 定技术。最初该方法仅用于免疫电镜技术，现在已经发 展到被动凝集试验、光镜染色、免疫印迹、免疫斑点渗 滤法以及免疫层析技术等。目前已广泛应用于临床诊 断，尤其是在医学临床检验中的应用，如早孕、乙肝、寄 生虫、性病和病毒细菌病的检测。而动物医学临床诊断 方面的应用起步较晚，最近几年才偶有报道，但作为临 床诊断试剂盒开发应用的还很少。该方法最大特点是 单份测定、简单快速、特异敏感，像层析试纸条技术，不 需任何仪器设备和试剂，几分钟就可用肉眼观察到颜 色鲜明的实验结果，并可保存实验结果。免疫胶体金层 析技术现已成为当今最快速敏感的免疫学检测技术之 一，特别适合于广大基层单位、医院、野外作业人员以 及大批量时间紧的检测和大面积普查等，因此该技术 具有巨大的发展潜力和应用前景。现就该技术的原理、 方法和发展前景作一简要综述。

1. 免疫胶体金技术

1.1 胶体金用于标记的原理

胶体金是一种负电荷的疏水胶，靠静电粒子相互排斥作用来维持稳定的胶体体系，其颗粒散在、红色，直 径从几纳米到几十纳米不等。由于不同直径的胶体金 的光散射各异，所以其溶胶颜色的深浅相应发生显著 的变化，这就是胶体金用于被动凝集试验的基础。同时 由于胶体金金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可与@AB、=>?、毒素、糖蛋白、酶、抗生素和激素等多种物质 非共价结合，从而使其成为免疫反应的优良标记物。而且金颗粒还可催化银离子还原成金属银，因此在胶体 金免疫测定时加入银染色液，能放大反应信号，大大增加测定的灵敏度。

1.2 胶体金的制备 一般采用还原法，即将氯金酸或四氯化金与适当的还原剂作用而使其还原成胶体金。 常用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸钠、白磷 和硼氢化钠等。根据需要可通过加入不同种类和剂量 的还原剂来调节胶体金颗粒的大小。将纯化好的胶体 金用0.02 mol/L TBS缓冲液1:20稀释，测OD值见表 1。

1.3免疫胶体金的制备 由于胶体金颗粒在电解质中不稳定，制备后应立即用大分子 （如蛋白质）进行标 记。胶体金溶液的PH值要调到稍高于标记用蛋白质的 :PI值。标记前需将蛋白质先用双蒸水透析以除去影响标记的电解质，接着经微孔滤膜过滤或超速离心以除 去细小颗粒，然后通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的蛋白质溶液的最低浓度，在此基础上再加10-20%，即为最佳标记量。标记好的免疫胶体金溶液还应 加入聚乙二醇20000（peg20000）至终浓度为0.05% 或 牛血清白蛋白（BSA）至终浓度为 &Q 作稳定剂。标记好的免疫胶体金溶液可4保存数月。

1.3 胶体金PH值的调节 胶体金标记蛋白质的成功与否，关键取决于 PH值。一般只有在蛋白质等电点（pi）稍偏碱的条件下二者才能牢固结合，因此，标记之 前须将胶体金溶液的 PH 值调到与待标记的蛋白质的 等 电 点 稍 偏 碱 。需 要 调 高 胶 体 金 的PH 值 时 可 用0.1mol/L K2CO3，需 要 降低 胶 体金 的 PH 值 时 可用0.1MOL/L HCL或0.1MOL/L HAC。特别需要提醒的是测 定胶体金溶液的PH 值可能会损害 PH测定仪的探头，只要用精密的PH试纸测定其 PH 值即可，详见表 3。

1.4  免疫胶体金的纯化 纯化免疫胶体金主要是除去其中未标记的蛋白质，未充分标记的胶体金以及在 标记中可能形成的各种聚合物。纯化方法有离心法和 凝胶过滤法等。可根据不同颗粒大小的胶体金溶液选 择不同转速 /见表4，高速或超速离心、洗涤、过滤除 菌，以较高浓度保存免疫胶体金备用。如有非特异性凝集则不能再使用。

1.5 离心法：一般颗粒10nm以上的胶体金可高速离心，颗粒小于10nm的胶体金要用超速离心，在4离 心15min-1h不等，弃上清，沉淀用原体积的0.2mol/lTBS（含 1% BSA，0.05% 叠氮钠）溶解，重复离 心2-3次，沉淀溶于原体积1/10tbs溶液中，4摄氏度保存备用。若要得到颗粒均匀一致的免疫金试剂，可将 离心提纯的免疫金继续用10-30%蔗糖或甘油溶液作密度梯度离心，分带收集不同大小颗粒的免疫胶体 金，然后透析除去蔗糖或甘油。

免疫胶体金技术的应用现状

胶体金用于免疫学 检测研究是20世纪80年代发展起来的一项新技术， muller等 应用该技术对牛痘病毒进行了免疫电 镜研究，geo 等和 leu等应用胶体金进行了被动凝集试验，;euvering等 利用 胶体金做了早孕诊断研究。进入90 年代，免疫胶体金检测试剂开始在人体医学上逐渐研发应用，目前已有 数十种检测试剂在临床上应用。而动物医学方面的检测起步较晚，近几年报道的较多，已经开始引起兽医界 的重视。免疫金传统方法主要应用在被动凝集试验、免疫金电镜染色法、免疫金光镜染色法和胶体金染色免 疫印迹法，目前应用较多的为斑点免疫金渗滤法和胶体金免疫层析法。现就这两项技术的应用作一介绍。

胶体金免疫层析法 （GIGA）快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层 析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术。近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医 学检验中得到了广泛应用。该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记试剂 吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体 金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特 异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而流离标记物则越 过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。周继文等建立了用胶体金标记乙肝表面抗体制成免疫 层析试纸条检测血液中的乙肝表面抗原，灵敏度可达1ng/ml，与酶免疫法比较，两法符合率为99%。李志 梁等 利用胶体金标记抗人心肌肌钙蛋白 T检测 cTnT 的试纸条，灵敏度可达0.5ng/ml，并与国外同类产品比较，符合率达 92%。吴英松等利用胶体金标记抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶单抗制成诊断恶性疟原虫的免疫层析条，检测重组恶性疟原虫乳 酸脱氢酶最低检测量为1ng。由北京世纪元亨动物防疫技术有限公司生产，农业部兽医诊断中心监制的犬细小病毒快速诊断试纸也已面市。 黄印尧等 将胶体金标记猪瘟抗原用于检测猪瘟抗体的免疫金标试纸条，与 Dot-ELISA 和间接血凝法 的符合率达100%。

免疫胶体金技术的发展前景

自免疫胶体金层析 技术作为诊断试剂广泛应用到临床后，由于它的快速 简便、准确，具有高度特异性和高敏感性，结果直观可 靠，而且试剂和样品用量极少，每个样品只需1-2ul， 无需仪器设备，简化了烦琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差，是一种目前发展最快的复合 型免疫层析技术。胶体金免疫层析技术与 ELISA技术原理不尽相同，前者技术要求更高，实施更为困难。其 主要原因在于胶体金免疫层析技术发展快，时间较短；层析材料主要采用国外产品，国内产品尚无法达到要 求。胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害，金 标记物比酶标记物更稳定，试验结果可以长期保存而不腿色。DICA试验中质控点可用来监测质量和实验操作，保证了整个试验的有效性。目前该技术已经在临床医学检验广泛应用，如激素（早孕、LH 等）、传染病病原 的抗体和抗原 （甲肝、乙肝、丙肝、爱滋病、乙脑、流感 等）、性病（梅毒螺旋体抗体、淋球菌等）、细菌 （结核杆 菌抗体、沙门氏菌抗体等）、寄生虫（弓形虫、包虫、血吸 虫、人囊虫等）、肿瘤标记物（甲胎蛋白、血清癌胚抗原 等）、心血管病检测标记物 （血清心肌钙蛋白等）以及大 麻、吗啡、海洛因等。这已经充分显示了该技术的应用前景仍将越来越广阔。该技术在动物医学研究虽然起 步较晚，但可喜的是已经有诊断试剂面市，随着该技术的不断研究和发展，必将为兽医临床诊断试剂研究提 供更加快速简便、商品化自动化的新途径。该法被认为是微生物和传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前 途的新技术之一，并且可以进一步研发定量或半定量检测试纸条以及通用检测试纸条，以促进我国畜牧兽 医事业的健康快速和持续发展。