糖化血红蛋白测定的标准化现状

萝卜涨价了

我国糖尿病患病人数已达9200万，居世界首位，同时还有糖尿病前期患者1．48亿J。在我国，绝大多数糖尿病患者为2型糖尿病，由其引发高血压、脑梗塞、冠状动脉粥样硬化性心脏病、糖尿病肾病综合征等并发症的控制率不足。早在20世纪90年代，美国、英国便先后对1型、2型糖尿病患者进行了为期10年的大规模临床病例研究，即糖尿病控制与合并症试验(DiabetesControlandComplicationsTrial，DCCT)和英国糖尿病前瞻性研究(UKProspectiveDiabetesStudy，UKPDS)，发现糖尿病并发症的减少和糖化血红蛋白(glycotedhemoglobin，GHb)的降低有关，并证实GHb的微小降低可明显减少糖尿病相关病死率及慢性并发症的发生2引。近几年来的多部基于循证医学的大规模多中心队列研究表明，GHb还可用于预测糖尿病，并且可作为心脑血管疾病和全因死亡的独立风险因子。2007年，美国糖尿病协会(AmericanDiabetesAssociation，ADA)、欧洲糖尿病研究协会(EuropeanAssociationfortheStudyofDiabetes，EASD)、国际临床化学协会(InternationalFederationofClinicalChemistry，IFCC)、国际糖尿病联合会(InternationalDiabetesFederation，IDF)联合发布了一份声明。该声明的主要目的是希望在全球范围内实现糖化血红蛋白检测的标准化2009年6月，上述组织及其共同组织的国际专家委员会，在分析了埃及、匹马印第安、全美健康和营养调查的3项横断面流行病学资料的基础上发布了一份应用HbA。诊断糖尿病的报告，建议采用HbAI>6．5％作为非妊娠糖尿病的诊断切点(cut—off)J，ADA在2010年初发布的糖尿病诊疗指南中采纳此项建议，以HbA≥6．5％作为糖尿病的诊断标准J。HbA不仅是反映血糖控制、治疗达标的指标，它在糖尿病预测、诊断、预后判定上也具有重要的价值，而目前我国临床实验室HbA测定总误差尚未能完全满足临床需求。鉴于此，中国糖尿病协会尚未推荐其作为我们国家糖尿病诊断标准。

一、HbA测定的常规方法及其影响因素

成人血红蛋白(hemoglobin，Hb)主要由HbA(97％)、少量的HbA：(2．5％)和HbF(0．5％)组成。HbA由4条肽链构成：包括2条0【链和2条B链。而HbA经色谱分析后，又可分为HbAHbAb和HbA。，统称为HbA，HbA的主要成分是HbA约占80％，目前，国际上定义HbA化学构成为葡萄糖稳定的连接在血红蛋白B链N末端缬氨酸(Va1)残基上，即血红蛋白(血液)一N一(1一脱氧果糖基)血红蛋白B链(13N一1一deoxyfructosy1．hemoglobin)71。书面表达使用“HbA1”，也可以简写成“A1C”。

葡萄糖进入红细胞后与血红蛋白HbA的B链N末端缬氨酸残基缩合，先形成一种不稳定的Schif碱(醛亚胺结构)，即前HbA再解离或经Amadori分子重排后形成HbA(醛酮结构)，此反应的过程是缓慢和不可逆的，并且由于红细胞内没有分解醛酮的酶，因此HbA。浓度只与红细胞寿命和该时期体内血糖的平均浓度有关，不受运动或食物的影响，反映的是过去6～8周的平均血糖浓度，是目前国际上公认的用于评估糖尿病患者长期血糖状况的最好指标。

到目前为止，有超过20种不同的方法用于测量HbA其主要的检测原理主要有3种。

1．离子交换层析法：它是基于不同组分的电荷差异进行分离的。葡萄糖与Hb的p链N末端Val连接降低了等电点，导至糖化Hb带的正电荷比未糖化Hb的少，与树脂的附着力小，可以分别用不同离子浓度的缓冲液在不同的时间将Hb从阳离子交换柱中洗脱下来，再根据每个峰值下的面积来计算HbA。占总Hb的比例。但是该方法中Hb变异体会随HbA。一起洗脱，影响HbA值，离子交换层析法受温度、pH值、抗凝剂和柱效的影响较大，从而使结果产生偏差_8j。常规的离子交换HPLC法经过多年技术上的改进，检测精密度(CV)<1％、分辨率及抵抗多种糖化血红蛋白变异体的能力有了明显提高，基本可以达到临床需求，美国糖化血红蛋白标准化计划(NationalGlycohemoglobinStandardizationProgram，NGSP)的参考实验室也是使用Bio-Rex70阳离子交换树脂HPLC作为常规实验标准参考方法，但是非特异性的问题仍然不能完全克服。

2．亲和层析法：用于分离糖化与非糖化血红蛋白的亲和层析凝胶柱是交联了间氨基苯硼酸的琼脂糖珠。硼酸具有与整合在血红蛋白分子上葡萄糖的顺位二醇基作可逆结合反应的性质，致使HbA选择性地结合于柱上，而非糖化血红蛋白被洗脱，然后变换条件，又可以将HbA重新解离，获得纯化¨。除葡萄糖外，血液中其他糖类都可与硼酸基结合，因此该方法的检测结果为GHb总量，而不是HbA。的含量，该方法不受温度、GHb变异体的影响，通过校准，其结果与离子交换法有良好的相关性，已被临床广泛采用。但该实验测定结果受到除血红蛋白B链N末端缬氨酸残基以外糖基化的影响。

3．免疫法：利用抗原、抗体反应的原理，使用单克隆或多克隆抗体与血红蛋白3-链上糖基化的N末端的4～8个氨基酸作为抗体识别位点，发生凝集反应，通过吸光度来测定凝集量，可用全自动生化分析仪进行检测。该抗原与IFCC参考系统用于制备一级参考物质的B链N末端6个氨基酸肽端极为相似，其参考范围(2．8％～4．9％)比其他方法更低，而与IFCC推荐的(2．85％～3．81％)更为一致。但是，当Hb发生第6位氨基酸变异[HbS(136~u一)和HbC(B“)]时将不会被识别，有报道对此变异进行实验显示，厂家间的检测结果存在着偏倚。2011年，参加卫生部临床检验中心HbA项目的实验室中，离子交换高效液相色谱和免疫比浊法最为普遍，实验室所占比例超过45％和25％。张传宝等¨对3个基于高效液相色谱和1个基于免疫比浊法原理的HbA测定系统的精密度和正确度进行验证，免疫法批内精密度CV为0．54％～1．02％，室内精密度CV为0．54％～1．17％；测定标准物质的均值(NGSP值)和标准物质定值的偏倚为一0．34％HbA】～一0．18％HbA与IFCC定值导出的NGSP值的偏倚为一0．14％HbA1。～0．05％HbA批内精密度和实验室内精密度及正确度性能均符合相关要求，认为可以满足临床工作的需要，具有广阔的应用前景。

二、GHb测定的标准化进程

尽管HbA。标准化测定的问题早在1984年即已提出13]，但直到1993年DCCT的结果发布后，才开始受到关注。美国、日本和瑞典等国家都分别建立了HbA国家标准纲要，其中最为“著名”的是NGSP。NGSP参考系统是以DCCT数值为基础，把NGSP参考实验室网络中各种实验方法都校准为DCCT参考方法，并建议各实验室只能采用被NGSP认可的方法来检测HbA使临床实验室的检测结果与DCCT的检测结果更具有相关性，大大减少了各实验室之间的差异。

NGSP主要内容为：NGSP管理委员会下设由中心参考实验室、一级参考实验室和二级参考实验室组成的参考实验室网络，其主要的职责为：(1)负责参与生产厂家的仪器校准；(2)负责对实验室和厂家进行正确度认证；(3)对常规实验室进行能力验证(proficiencytest，PT)。自NGSP计划建立以来，美国临床实验室间HbA。。测定的结果“从混乱进入有序”状态，目前参加NGSP活动的实验室室间CV小于5％，HbA结果与NGSP靶值的偏差小于0．8％，并且自2005年以后，参加美国病理家协会(CollegeofAmericanPathologistsCAP)HbA室间质评的实验室，95％以上均经过了NGSP认证，经过CAP和NGSP两组织的共同监测，推进了临床实验室关于糖化血红蛋白的检测质量。

1995年，日本糖尿病学会(JapaneseDiabetesSociety，JDS)采用HPLC方法制备了国家级的校准品(JDSCalibratorlot1)，推荐用于所有的常规糖化血红蛋白检测方法的定标，对HbA检测进行标准化，并且经过几年的努力，日本临床化学学会(JapaneseSocietyofClinicalChemistry，JSCC)采用K0500制备了国家．Z-级校准品(JDS／JSCCCalibratorlot2)，实现了标准物质的溯源性。瑞典临床化学学会(SwedishSocietyofClinicalChemistry，SFKK)将MonoSHPLC方法作为国家指定参考方法，推荐用于糖化血红蛋白的标准化。具体实施内容为：每月1次，将乙二胺四乙酸抗凝的新鲜全血样本发放至40家使用HPLC方法的临床医院，其中有5家医院采用MonoSHPLC参考方法，从而达到对常规实验室的能力验证，并且作为重点关注的检验仪器，要求所有的医院每2年至少对糖化血红蛋白仪器进行校准1次。

上述参考方法均采用离子交换色谱法，由于受树脂种类、缓冲液组分、洗脱时间和色谱分辨率不同等原因的影响，检测结果也不同。在美国，DCCT和NGSP使用指定的参比方法，应用Bio—Rex70HPLC和瑞典的MonoSHPLC方法检测HbA在临界值仍有20％的差异，显然在度量学方面，无法满足参考方法的要求。

IFCC建立了HbA标准化工作组，旨在研究一个可供追溯的参照系统，研发HbA。参考物质和参考方法，该工作组历时5年的探索，经过多家实验室的努力，于2002年推出了一套HbA参考方法【14]，即将待测标本溶血后经胞内蛋白酶酶解，然后应用高效液相色谱串联电喷雾质谱仪或高效液相色谱串联毛细管电泳仪，利用信号比例计算出糖基化的B链N末端六肽片段的比例，从而得出HbA在样本中所占的百分比，是检测HbA分子浓度的新方法，此方法已经由包括欧洲、日本和美国在内的11家IFCC参考实验室验证。IFCC推荐的检测HbA方法的结果与DCCT的结果存在一定差异，其检测值较NGSP的HbA检测值低，两个方法相关系数R为1．000，室内CV为0．47％～2．07％，室间C为1．35％～2．27％LlSl。2004年，日本的Iguchi等¨，在酶裂解肽段基础上，利用同位素稀释质谱法测量糖化血红蛋白，使实验室内的C达到1．23％～1．99％。2008年，德国的Kaiser等在IFCC推荐的参考测量方法的基础上，应用C12替代了丙氰基，改良了HPLC．ESI／MS方法，获得了较高的信号强度和系统稳定性，室内CV达到0．71％～1．86％。2011年，西班牙的delCastillo等，利用多维液相色谱和电感耦合等离子体质谱法在分子和原子水平上测量HbA虽然经过各国科学家不断的改进，IFCC推荐的参考方法的精密度和稳定性均有了提高，但是由于实验操作比较复杂，耗时较长，仪器昂贵、维护和保养成本较高，目前仍只限于糖化血红蛋白标准化的研究。

三、糖化血红蛋白的标准物质研制进展

目前国际上关于HbA有证标准物质主要有：(1)比利时参考物质与测量研究所(InstituteforReferenceMaterialsandMeasurements，IRMM)提供的HbA1(IRMM466，纯度>98．5％)、HbA0(IRMM467，纯度>99．5％)和BCR-405。其中466和467混合成不同浓度可以为参考方法进行校准，BCR-405只用于质量控制。(2)日本临床化学标准与参考物质研究所(ReCCS)出品的JDSLot2。虽然JDSLot2有5个浓度水平，但是仍只能溯源到HPLC的参考方法。

我国HbA测定标准化工作起步较晚，目前仍处于初级阶段。卫生部临床检验中心王冬环等建立了高效液相色谱串联电喷雾质谱法准确测量HbA。的参考方法(不同浓度血样及国际标准物质批内变异系数CV平均为0．70％，总CV为0．85％，测定国际标准物质，测定值与认定值的偏差为一0．8％一0．25％)并研制了基于质谱方法的HbA国家一级标准物质(GBW09181、GBW09182、GBW09183)，这为HbA的准确测量和量值溯源提供了有力的物质保障。

四、我国HbA，一致性计划及质量管理

由于我国目前HbA测定的方法、实验价格、地区医疗水平的差异等原因，HbA的测定并未普及，HbA作为糖尿病诊断指标也存在亟须解决问题，主要是我国HbA。检测方法的标准化程度不够，测定的仪器和质量控制尚不能符合目前糖尿病诊断标准的要求，因此目前暂不推荐应用HbA。。诊断糖尿病，但是为提高我国糖尿病的诊断、治疗、管理水平，2010年3月中国HbA。教育计划在京启动，该计划是国内首次由内分泌和检验界专家共同参与的大型学术活动，旨在提高HbA。在糖尿病管理中的重要地位，加强临床医师对HbA的认识和重视。

由于没有国家标准，国内开展HbA实验室检测现状很不理想，各实验室采用的HbA检测系统很多，甚至很多实验室仍在采用非标准化的方法，缺乏相关的参考实验室网络及正确性验证的途径，结果可比性不容乐观。2010年卫生部临检中心室间质评不同仪器组内CV为4．54％～21．03％。2011年北京市临床检验中心HbA，室间质评的结果显示，相同仪器组内CV基本在4％以下，虽显示了很好的精密度，但是不同仪器组间CV仍高达15．8％，检测结果的可比性较差，无法达到HbA检测结果的互认。

2011年1月，由复旦大学附属中山医院潘柏申教授牵头，与上海交通大学附属瑞金医院内分泌代谢病研究所和上海交通大学附属第六人民医院糖尿病研究所3家具有NGSP资质的实验室共同组织了上海地区HbA一致性计划，希望以上述3家医院新鲜定值全血及新鲜全血比对的形式传递HbA。一致性，并要求所有参加实验室CV<5％，检测值与参考实验室定值偏差<±8％，参与该计划的实验室每季度可得到参考实验室发放的2个浓度的新鲜定值全血标本，以及20份新鲜全血比对标本，检测结果与参考实验室之间进行比对(详细数据可参见：http：／／www．zs—hospita1．sh．cn／lab／shgsp．asp)。上海HbA1一致化工作，为中国HbA标准化工作提供了宝贵经验。

虽然IFCC推荐的参考方法较NGSP参考方法特异性强，但是值得注意的是，NGSP具有更广泛的临床实践和应用基础，目前国际上关于两种参考方法比较统一的共识是，HbA检测的仪器厂家方应溯源到IFCC推荐的参考方法，而常规实验室方法应得到NGSP的认可J。但参加NGSP价格贵，且IFCC和NGSP之间如何接轨尚未见到共识的发表。2011年初，美国生化科学院发布实验室检测在糖尿病诊断和管理中的应用与建议中指出，测定HbA，的室内变异<2％，室间变异<3．5％，并至少需要做2个水平的质控物(具体内容见：http：／／www．aacc．org／members／nacb)，而在我国，整合和开发现有资源，积极开展HbA测定的一致性和标准化工作，实现HbA检验结果的互认仍将任重而道远。