什么是种特异巢式PCR？原理操作流程应用介绍

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一、引言
微生物在其分类中有严格的分类方法,例如门(phym)、纲(clas9、目( order)、科( family)、属( genus)、种( species),种是生物分类中基本的分类单元和分类等级。属于同一种的微生物在进化中形成了一部分保守的基因序列,针对种特异的基因设计引物,能够区分同一属内不同种的微生物在种特异PR中,扩增基因一般选择在较为保守的16 SrRNA和23 SrRNA内。
近几年来国外学者采用不同的分子生物学方法对细菌的16 S rRNa进行研究,得到了广泛的细菌16 S rRNA的序列库。使用该方法可以检测肠道中常规方法不能培养或生长缓慢的细菌。rRNA分子在生物体中普遍存在,生物细胞rRNA分子的一级结构中既具有保守的片段,又具有变化的碱基序列。在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区和可变区,保守的片段反映了生物物种间的亲缘关系,而高变片段则能表明物种间的差异,那些保守的或高变的特征性核苷酸序列则是不同分类级别生物(如科、属、种)鉴定的分子基础。研究rRNA基因序列可以发现各物种间的系统发生关系。细菌rRNA按沉降系数分为3种,分别为5S、16S和23SrRNA。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16 S rRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。16 S rDNA是细菌染色体上编码16 S rrNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌染色体基因中,它的内部结构由保守区及可变区两部分组成。因此可用PCR扩增其相应的rDNA片断,来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌,或进行细菌多样性分析,尤其是那些人工无法培养的微生物。现在人们已经认同16 SrrNA/rDNA基因序列可用于评价生物的遗传多态性和系统发生关系,在细菌分类学中可作为一个科学可靠的指标。在分类鉴定一些特殊环境下的微生物时,由于分离培养技术的限制,难以获得它们的纯培养进行生理生化学等指标的分析,这样16SRNA/rDNA序列分析的优越性就体现出来了。
二、材料
①模板:基因组DNA或cDNA。
②dNTP混合液:每种脱氧核糖核苷酸的浓度为2.5mmol/L。
③四条特异引物:两条外引物,两条内引物,浓度均为10pmol/L
④ Taq dNa聚合酶及其10×PCR缓冲液
⑤高压灭菌去离子水
⑥用于琼脂糖凝胶电泳的试剂。
⑦PCR扩增仪
三、方法
1.模板
利用基因组提取试剂盒提取临床标本或者培养物中的基因组DNA,DNA重悬于无菌水中,定量为1g/ml
2.引物设计
通常在同一种内的微生物,16 S rDNA、23 S rDNA序列都较为保守,因此在种特异巢式PCR中,扩增的目的片段通常选择在这些序列中,也可选择其它较为保守的序列。通过进化树分析,选择那些种内保守而又能够区分不同种的序列来设计引物。扩增片段大小没有固定的要求,通常在引物中不设计简并碱基。引物设计原则同常规PCR。外引物可以针对同一属的保守序列,而内引物可以针对种特异的序列保守区,从而通过种特异PCR区分同一属内的不同种微生物
3.操作方法
①设立50l的PCR反应体系,在0.25ml的PCR管中,分别加入:
10×PCR缓冲液          5μlDNA或cDNA模板
2.5 mmol/L的dNTP混合液            1 ul Taq dnA聚合酶(5U/p)            0.5ul
10ymol/L的外引物(Pl、P2)           各1ul        H2O            至50l
如果PCR仪没有热盖,在反应液上加一滴矿物油(约50l)。将PCR试管放入到PCR仪上。
②设置PCR反应条件。
预变性            94℃,3min
变性              94℃,3min
退火               55℃,30s
延伸               72℃,60s     变性-退火-延伸 30个玄幻
延伸               72℃,7min
PCR反应中的温度要根据具体反应而定,一般来说每分钟合成1000bp左右。
③进行第二轮PCR反应,在0.25m的PCR管中,分别加入:
10×PCR缓冲液       5        以第一轮PCR产物
2.5mmol/L的dNTP混合液         1 ul Taq dnA聚合酶(5U/pl)         0.5ul
10ymol/L的内引物(P3、P4)        各1ul   H2O       至50l
PCR反应条件同第一轮。
④PCR产物的检测
反应结束后,用10第二轮PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳分析。
四、注意事项
在引物的设计方面需要进行严格分析。由干16 SrNA序列在原核生物中的高度保守性,对于相近种或同一种内的不同菌株之间的鉴别分辨力较差。23 S rRNA分子比较大(约3kb),并且只有少数种的核酸序列被报道,尚未在细菌的分类和鉴定中得到广泛应用。16~23 S rDNA区间( Intergenic spacer region,ISR)由于没有特定功能和进化速率,比16 S rDNA大10多倍,近几年来在细菌鉴定和分类方面备受关注。一些细菌的165~23 S rDNA ISR的数目、大小和序列已经报道,它们之间的不同使其在细菌系统发育学,特别是相近种和菌株的区分和鉴定方面占据了一席之地。因此要根据实验要求选择不同的保守区设计引物。
五、应用与小结
Sturbaum G D等利用种特异巢式PCR联合限制性片段长度多态性(RFLP)对一种寄生虫Cryptosporidium parvum的卵进行检测。他们设计的引物位于18SRNA区域内,通过对1个、2个、3个、4个、5个、7个和10个卵的检测来评价此种PCR方法的敏感性,发现利用PCR扩增单个卵基因是可行的,但敏感性需要进一步提高。 Matsuki t等2利用针对于16 S rDNA的属特异和种特异PCR来检测双歧杆菌( bifidobacteria)。他们提取人排泄物中的基因组,发现在成年人中链状双歧菌( Bifidobacterium catenulatum)菌群是最常被检测出来的菌群,在吃奶的孩子,短双歧菌( Bi fidobacterium breve)是最常被检测出来的菌群。利用针对于16 S rDNA区的实时定量PCR可望检测出排泄物的不同菌群的数量,此种技术对于检测肠道中的菌群的动态分布提供了很好的方法。 Balotra p.等利用针对于莱什曼原虫( Leishmania donouani)动力体( Kinetoplast)kDNA的种特异PCR检测临床样品中 Leishmania donouani的感染状况。

黄先生

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