ddPCR在肿瘤早期筛查中的应用

纳兰烙烙

世界卫生组织（WHO）明确指出：癌症患者如果能早期发现，治愈率可达到 80%。循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA, ctDNA）作为肿瘤标记物之一，携带有与原发肿瘤组织相一致的分子遗传学改变（如基因突变、抑癌基因启动子高甲基化、微卫星不稳定和杂合性缺失等）。这可为肿瘤的早期诊断提供重要的信息。

早在 1989 年，Stroun 等首先对肿瘤患者体内的游离循环 DNA 序列进行了检测，在肿瘤患者体内的游离循环DNA上相继检测到了 K-ras、N-ras、P53、APC 等基因的突变。研究人员通过对胃肠肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈肿瘤、泌尿体统肿瘤、妇科肿瘤和皮肤癌等多种肿瘤的研究，游离循环 DNA 的检测被认为是一个潜在的肿瘤早期诊断和预后判断的有力手段。

循环肿瘤DNA与肿瘤早期筛查

在肿瘤形成的早期阶段，会出现肿瘤细胞的坏死和凋亡，这些坏死或凋亡的肿瘤细胞可以释放其 DNA 进入外周血形成血浆或血清游离 DNA；增殖旺盛的肿瘤细胞也能持续释放 DNA 进入血液循环。只需从受检者体内抽血 1ml 外周血，专业人员利用微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR）进行癌症相关的靶向基因检测，根据受检者血液中是否含有某种肿瘤特异的游离循环 DNA 及其数量的多少，精准的确认相应基因的突变频率，达到肿瘤早期筛查目的。

注：循环DNA是一种无细胞状态的胞外 DNA，存在于血液(血清或血浆)，滑膜液和脑脊液等液体中，其主要是由单链或双链 DNA 以及单链与双链 DNA 的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离 DNA 两种形式存在。正常人循环血液中存在少量游离 DNA，主要来源于细胞核 DNA 和线粒体 DNA，常小于 10ng/ml；肿瘤患者循环 DNA 主要来源于肿瘤细胞，其血浆 DNA 浓度平均可达 180ng/ml。

临床常用肿瘤筛查检测方法比较

什么是微滴式数字PCR（DDPCR）

微滴式数字PCR（Droplet Digital PCR, DDPCR）是第三代 PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术，是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。其灵敏度非常高，且只需要很少的模板量；尤其适用于痕量、不易得到的待检样品；弥补了第二代 PCR 系统难以精确测定基因拷贝数、无法对痕量突变定性和定量、精确度低等缺点。微滴技术结合PCR，使这项技术能满足更多临床检验的需求，更精确，更数字化。非常适合一些稀有样本中核酸的精确检测，可有效适用于肿瘤的早期筛查、肿瘤继发性耐药检测及肿瘤负荷实时监控等。

微滴式数字PCR（DDPCR）技术优势：

· 单分子分析：将微量临床样本再细分成 2 万个微滴，实现临床样本的“单分子分析”；

· 真正意义上的绝对定量，可统计突变率：无需标准曲线；检测下限可低至单拷贝；不依赖ct值，不依赖扩增效率，能克服 PCR 抑制剂的影响；

· 所需样本量少：200ul 血浆或 1ml 全血 / 4-5片白片；

· 数据分析自动化：每个微滴的检测结果以阴性、阳性标示，由设备直接判断；

· 灵敏度高达 0.001%：在穿刺样本、胸腹水、外周血、尿液中即可完成靶标序列检测；

· 使用灵活：可按实验需要调整通量和灵敏度。

微滴式数字PCR（DDPCR）肿瘤早期筛查项目

微滴式数字PCR（DDPCR）肿瘤早期筛查项目可一次性检测与肿瘤发生发展密切相关的 9 个基因 48 个常见突变位点，癌基因信息来源于国际癌症基因普查报告（Cancer Gene Census, CGC），覆盖常见恶性肿瘤，例如肝癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、甲状腺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤、脑胶质瘤等，只需抽取受检者 4ml 外周血，即可实现肿瘤早期无创检测。

肿瘤早期筛查使用人群

在肿瘤早期筛查检测室，应综合考虑被检者患病史、家族患病史及环境因素，有针对性的对高危人群进行肿瘤早期筛查检测。

· 有肿瘤家族史或有遗传易感性的人群：例如乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、前列腺癌或肾癌等肿瘤多为遗传性，具有家族聚集性；对于肝癌和肺癌易感人群，建议进行早期筛查检测。

· 有慢性炎症或癌前病变人群：慢性肝炎和肝硬化，声带息肉，甲状腺结节，宫颈糜烂，宫颈息肉，皮肤角化症，粘膜白斑病，皮肤慢性溃疡等。

· 高危人群：因职业和环境原因长期接触有害化学物质或放射线人群；

· 长期吸烟、饮酒者，过多摄入高脂肪食物导至肥胖者；

· 疑似肿瘤患者：身体里发现可疑肿块或病理检查有不典型增生者；进行肿瘤早期筛查，可以从分子层面鉴定是否有基因突变，控制癌前病变；

· 康复期癌症患者：既往曾患癌症，经治疗后可定期做肿瘤早期筛查检测，从分子层面监控是否再次出现原有的基因突变，能够较临床检查更早发现肿瘤的复发迹象，用于预后的评估。

微滴式数字PCR（DDPCR）肿瘤早期筛查的指导意义

战胜癌症，早期预防、早期发现是关键——

· 细胞的恶变具有潜在的可逆性：早期发现恶变细胞踪迹，通过干预手段（提高自身免疫力），可逆转。

· 三个三分之一：肿瘤 1/3 的可预防的，1/3 是能够治愈的，还有 1/3 也能延长生命，减少痛苦。

· “预防就是治疗”（《众病之王：癌症传》），肺癌患者如果在早期发现，5 年存活率是 90%,而晚期患者 90% 都会死亡。恶性

肿瘤在一期发现，可以完整切除，结合化疗，如果没有复发或转移，长期生存率在 80% 以上。

通过微滴式数字PCR（DDPCR）技术对外周血中肿瘤游离DNA进行检测，对肿瘤的发现远早于影响及其他蛋白或多糖类肿瘤标志物的相关检测。若检测结果提示阳性，被检者可在肿瘤形成的启动阶段就采取相应干预措施，阻止和减缓肿瘤的恶化过程，延长患者生存期。

1、癌症潜伏期或癌症病变状态：检查出有基因突变，经临床进一步检查未发现肿块，说明机体存在突变的恶性细胞，预示可能是癌症前期，或超早期癌症状态。

2、已是癌症患者：如果检查出有基因突变，且突变量高，可通过影像学或内窥镜等临床检查寻找到肿块的位置，争取尽早治疗。

3、癌症复发：曾经罹患癌症的患者，如血液中发现既往的基因突变类型，预示存在有癌症复发的可能。

来源：检验频道，MIR医学仪器与试剂