IVD产品经理系列—寻找特检项目（6）

纳兰烙烙

很多人跟小编留言，希望多多更新产品经理特检系列。今天小编将为大家带来的特检项目是：华法林耐药系列检测

节选《2013华法林抗凝治疗的中国专家共识》

什么是华法林？

华法林为香豆素类抗凝药，通过抑制肝脏维生素K环氧化物还原酶，使无活性的氧化型维生素K(KO) 无法转化为有活性的还原型维生K(KH2) ，阻断维生素K的循环利用，干扰维生素K依赖性凝血因子II、VII、IX、X 及抗凝蛋白C、抗凝蛋白S的合成，阻碍凝血因子氨基末端谷氨酸残基的γ羧化作用，使凝血因子停留在无活性的前体阶段而达到抗凝目的。

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华法林的生理作用是什么？

1)体内抗凝：体外无效.

2)起效慢：对已形成的凝血因子无抑制作用，需待以合成的凝血因子耗竭后才能发挥作用，一般需8-12h后发挥作用，2-3d达高峰，故用药早期与肝素钠并用。

3)作用持续时间长：停药后，抗凝作用仍能持续4-5d，与维生素K依赖性凝血因子凝血因子II、VII、IX、X再合成有关。

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4)华法林不足之处：

华法林血药浓度与疗效存在明显个体差异和种族差异，药物安全范围窄且存在较多的影响因素，使得华法林剂量不易掌握. 在用药期间需要监测凝血酶原时间(PT)和国际标准化比值(INR).应根据PT和INR调整华法林使用剂量，达到“理想抗凝强度”。

华法林的量效关系受遗传和环境因素影响。

1．遗传因素

(1)华法林相关的药物基因多态性。

(2)华法林的先天性抵抗，先天性华法林抵抗的病 人需要高出平均5—20倍的剂量才能达到抗凝疗效，可能与华法林和肝脏受体的亲和力不同有关。

(3)凝血因子的基因突变。

2．环境因素：药物、饮食、各种疾病状态均可改变华法林的药代动力学。

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目前对华法林基因多态性研究较多且对华法林剂量个体差异起关键作用的是细胞色素P4502C9(CYP2C9)基因和维生素K环氧化物还原酶复合体1(VKORC1)的基因多态性。

(1).CYP2C9基因

1） 华法林由S－和Ｒ－对映异构体组成的消旋体,在稳定状态下,S－华法林提供了60%～70%抗凝活性,S－华法林85%以上由CYP2C9代谢为无活性的6－和7－羟基化物.

2）CYP2C9基因存在野生型CYP2C9*1和变异型CYP2C9*2～CYP2C9*13,CYP2C9*2和CYP2C9*3变异可使CYP2C9酶活性降低,华法林的代谢及消除减少而导至出血并发症的发生.

3）研究表明携带CYP2C9*1型基因的个体所需华法林剂量明显高于携带CYP2C9*2型和CYP2C9*3型基因的个体,其出血并发症也明显降低.

（2).VKORC1基因

近年发现，编码维生素K环氧化物还原酶复合物(VKORC)的基因突变与华法林耐药及药效学差异有关。VKORC通过将维生素K环氧化物转换成维生素K的氢醌式，进而参与凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ及Ⅹ的活化。VKORC1(维生素K环氧化物还原酶复合物1)是VKORC的一个重要组分，也是华法林结合的一个靶点，其基因突变导至华法林与其结合力降低，抗凝作用减弱.

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华法林的剂量和监测

华法林抗凝强度的评价采用INR，INR是不同实验室测定的PT经过实验室敏感指数(Local ISI)校正后计算得到的。因此，不同实验室测定的INR具有可比性。

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1．抗凝强度：

华法林最佳的抗凝强度为INR 2．0～3．0，此时出血和血栓栓塞的危险均最低。不建议低强INR<2．0的抗凝治疗。

INR（international normalized ratio ），国际标准化比率的计算公式为： INR=PTRISI，ISI为国际敏感指数，代表凝血活酶的促凝活性（敏感性）；PTR为受试者PT与正常血浆PT的比值。

ISI反映了某种促凝血酶原激酶对Vit K依赖凝血因子减少的反应性，试剂反应性越好，ISI值越低。制造商会提供促凝血酶原激酶制剂的ISI值。

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2．初始剂量

中国人房颤的抗栓研究中华法林的维持剂量大约为3 mg

建议中国人的初始剂量为1～3 mg(国内华法林主要剂型为2．5 mg和3 mg)，可在2～4周达到目标范围。

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某些患者如老年、肝功能受损、充血性心力衰竭和出血高风险患者，初始剂量可适当降低。 如果需要快速抗凝，如VTE急性期治疗，给予普通肝素或低分子肝素与华法林重叠应用5 d以上，即在给予肝素的第1天或第2天即给予华法林，并调整剂量，当INR达到目标范围并持续2 d以上时，停用普通肝素或低分子肝素

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法华林不良反应

(1)出血：华法林导至出血事件的发生率因不同治疗人群而异。例如，在非瓣膜病房颤患者的前瞻性临床研究中，华法林目标为INR 2～3时严重出血的发生率为每年1．4％～3．4％，颅内出血的发生率为0．4％～0．8％

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服用华法林患者的出血风险与抗凝强度有关，还与患者是否为初始用药还是长期抗凝以及是否监测凝血有关。此外，与患者相关的最重要的出血危险因素为出血病史、年龄、肿瘤、肝脏和肾脏功能不全、卒中、酗酒、合并用药尤其是抗血小板药物。目前有多种评估方法应用于临床，其中HAS-BLED评分系统被推荐用于房颤患者。评分为0—2分者属于出血低风险患者，评分≥3分时提示患者出血风险增高。

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(2)非出血不良反应：除了出血外，华法林还有罕见的不良反应：急性血栓形成，可表现为皮肤坏死和肢体坏疽。通常在用药的第3～8天出现，可能与蛋白C和蛋白S缺乏有关。此外华法林还能干扰骨蛋白的合成，导至骨质疏松和血管钙化。

建立专业门诊，加强对长期服用抗凝治疗患者的抗凝管理。

INR即时检测技术(point．of-care test，POCT)，只需一滴指血，可即时报告检测结果，大大简化了抗凝治疗的检测流程。

华法林的市场价值

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小编为什么会提到华法林耐药检测类项目为特检项目呢。

首先它符合以下几个特征：

1）多方法学应用，且方法学互补而非互相替代。

2）可以在筛查、诊断、随访各个阶段参与，并且检测频率极高。

3）物价收费偏高，市场运作价值较大。

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一、检测频率

节选《华法林抗凝治疗中国专家共识》

3.4.1 住院患者口服华法林2-3天后开始每日或隔日监测INR，直到INR达到治疗目标并维持至少两天。此后，根据INR结果的稳定性数天支1周监测1次，根据情况可延长，出院后可每4周监测1次。

3.4.2 门诊患者剂量稳定前应数天至每周监测一次，当INR稳定后，可以每4周监测一次。如果需调整剂量，应重复前面所述的监测频率直到剂量再次稳定。

由于老年患者华法林清除减少，合并其他疾病或合并用药较多，应加强监测。长期服用华法林患者INR的监测频率受患者依从性、合并疾病、合并用药药物、饮食调整等因素影响。服用华法林INR稳定的患者最长可以3个月 监测一次INR。

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深静脉血栓形成和肺栓塞患者急性期治疗应采用静脉抗凝药物，通常VTE患者急性期后华法林抗凝至少要3个月，如果静脉血栓栓塞症的原因不清楚或者危险因素不能消除，则应该考虑长期抗凝治疗。

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所有长期抗凝治疗的患者都应该定期（每年）再评估血栓和出血危险。

5.1.1 如果VTE的发生为外科手术或一过性因素所致，推荐抗凝3个月。

5.1.2 首次发生的VTE，如果出血危险高，也建议抗凝治疗3个月。

5.1.3 复发的VTE，出血危险高的患者，应该抗凝治疗3个月；出血危险不高，应该长期抗凝。

5.1.4 首次发生的没有原因的VTE，出血危险不高，应长期抗凝。

5.1.5 VTE合并活动性肿瘤的患者，出血危险不高，应长期抗凝。

5.1.6 有血栓形成倾向和复发的患者抗凝治疗时间也应该延长。

5.1.7 所有慢性血栓栓塞性肺动脉高压(CTPH) 患者，应华法林终生治疗。

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5.2 心脏瓣膜病

心脏瓣膜病合并下列情况时应给予华法林抗凝：

5.2.1 风湿性二尖瓣病合并窦性心律的患者，如左心房大于55mm或已经发现左心房血栓的患者；

5.2.2 风湿性二尖瓣病合并心房颤动的患者或发生过栓塞的患者。

5.2.3 原因不明的卒中合并卵圆口未闭或房间隔膜部瘤，如服用阿司匹林卒中复发的患者。

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5.2.4 植入人工生物瓣膜的患者，二尖瓣尖瓣置换术后建议服用华法林3个月。

5.2.5 植入人工机械瓣膜的患者，根据不同类型的人工瓣膜以及伴随血栓栓塞的危险来进行抗凝。主动脉瓣置换术后INR目标为2.0－3.0，而二尖瓣置换术后建议INR目标为2.5－3.5，植入两个瓣膜的患者，建议INR目标为2.5－3.5。

5.2.6 植入人工瓣膜发生感染性心内膜炎的患者，应该首先停用华法林，随后评估患者是否需要进行外科手术干预以及是否有中枢神经系统受累的症状，确认患者病情稳定、无禁忌症和神经系统并发症后，可以重新开始华法林治疗。

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二、可检测项目

1）POCT血凝仪

在《现场即时检测INR水平的中国专家共识》中提到：

美国于1997年FDA批准口服抗凝药物治疗的患者可以应用POCT血凝仪进行INR自我监测。

英国于2005年出台《口服抗凝治疗自我管理指南》，建议应用POCT进行INR监测。

德国有抗凝自我管理协会（ASA）对医生和患者进行定期培训，大约有40万患者应用POCT血凝仪监测INR，通过自我管理模式进行合理的抗凝治疗。

而POCT血凝仪对于检验转周期（中心实验室检测从采血到得到实验结果的时间，turnaround time, TAT）对于早期诊断、早期治疗具有重要意义。

以往，PT/INR的检测主要在医院的中心实验室进行，虽然中心实验室可保证检测质量的可靠性，但检验前血标本运送时间长，很大程度上影响了INR检测结果的准确性；POCT血凝仪，只需患者一滴指血，即刻报告结果，极大缩短TAT时间。易于操作，使用方便、快捷，结果准确，是对中心实验室血凝监测方法的有利补充，尤其适用于ICU、急诊室、手术室和门诊患者。

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市场应用期待：

1、建议大医院建立抗凝或血栓栓塞防治门诊，与社区互动，对抗凝患者进行系统管理、主动服务和抗凝监测教育；

2、建议对农村县级医院和城区社区医务人员进行抗凝药物使用和抗凝监测方法的培训；3、建议抗凝门诊和能进行抗凝管理的县医院和社区优先选择应用POCT血凝仪进行抗凝监测；

4、建议急诊室配备POCT血凝仪；

5、出现急性出血并发症和血栓症以及需要接受有创操作的患者应用POCT血凝仪进行INR监测；

6、口服华法林患者应定期进行INR监测，每次间隔时间1个月，如服用剂量改变或生理状态、食物、合并用药改变要随时监测，建议应用POCT血凝仪。

2）华法林多态性基因检测

2015年颁布《药物代谢酶与药物作用靶点基因检测技术指南 (试行)》，规范药物基因组学行业发展，并提出“药物反应相关基因及其表达产物的分子检测是实施个体化药物治疗的前提”。

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美国FDA于2008年对华法林的说明书进行了更新，建议可通过基因多态性检测来帮助进行初始剂量的选择。基因多态性只能解释30％～60％的华法林个体差异。

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2017年9月26日，《美国医学会杂志》(IF=44.4) 发表一项重要研究结论：根据患者基因检测结果指导抗凝药物华法林的用药剂量，可以减少近三成的药物不良反应事件，包括大出血、死亡等。

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原文链接：http://jamanetwork.com/journals/ ... 54820?resultClick=1

CFDA与FDA针对基因多态性检测的态度

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国际华法林药物基因组学联合会（IWPC）剂量公式

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随着药物基因组学的发展，基因多态性对药物疗效及不良反应的影响逐渐被重视。目前FDA已经对约200种药物，提出需要患者基因信息指导精准治疗的建议。

华法林基因检测技术报告单模板

节选《上海新华医院药剂科张燕娥》

采用EDTA抗凝真空采血管（紫色帽头）采集外周静脉血2ml（无需空腹，无论是否用药，随时抽取血标本），药师将在2个工作日内出具基因检测报告，并提供个体化给药建议供临床参考。

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3）华法林血药浓度检测

方法学HPLC-MS/MS

之所以会发展出华法林血药浓度检测，最重要的原因是近年来，INR 监测抗凝不当导至并发症发生的情况已屡有报道。

因为华法林血浆药物浓度灵敏而稳定，可以用作口服抗凝剂的监测指标；其与INR 及PT 等抗凝监测指标结合有助于提高抗凝监测的准确性，减少抗凝并发症的发生。

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2012年在《对映体选择性LC-MS/MS 法测定人血浆中R/S-华法林及其在药物相互作用研究中的应用》【国家科技重大专项资助项目 (2009ZX09301-001)】中指出：R-华法林和S-华法林的分离度为1.56, 线性范围均为5～1 000 ng·mL&#8722;1, 日内和日间精密度 (RSD) 均小于10%, 准确度(RE) 在 &#8722;4.9%～0.7% 之间。该方法快速、灵敏, 适用于药物对华法林代谢相互作用的研究。结果表明, 吗啉硝唑对华法林无明显的代谢相互作用。

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华法林钠 (消旋体) 对照品 (纯度大于98%) 购自东京化成工业株式会社; R-华法林(纯度98%) 和S-华法林 (纯度98%) 系加拿大TRC股份有限公司产品; 甲氯噻嗪 (内标, 纯度99.6%),美国Applied Biosystems 公司API 4000型三重四极杆串联质谱仪, 配备电喷雾电离源 (ESI源), Analyst 1.4.2 定量处理软件, 日本岛津公司LC-20AD 型输液泵和SIL-HTA 型自动进样器。

2015年在《超高效液相串联质谱法检测人血浆中华法林及其代谢产物的浓度》一文中指出：黄晓会等 用HPLC 检测了30例患者的华法林血药浓度,检测限为100 ng·ml-1,本法检测华法林血浓度的最低定量限达5 ng·ml-1。此外,本法采用ACQUITY UPLC&#174; BEH C18柱,检测一个样本仅需要3 min,可以达到快速、稳定检测血浆中华法林和7-羟基华法林的浓度,为临床医生调整剂量奠定坚实的基础。

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华法林(美国Sigma 公司,批号:14508,纯度98%);醋酸;甲醇、乙腈(色谱纯,美国Fisher公司);患者血样(上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科)。Agilent1260 型高效液相色谱仪(配备自动进样器,四元梯度泵,柱温箱,二极管阵列检测器);梅特勒百万分之一电子天平;Mini-Q 纯水仪,T-150 超声波清洗器(北京天鹏有限公司,40 kHz,250 W)。

2017年在《肺栓塞患者华法林稳态血药浓度监测结果回顾分析》一文中指出：华法林的抗凝作用和引起出血的不良反应，受到环境因素(年龄、性别、体质量、身高、疾病、器官功能、饮食中维生素K的摄入)和遗传因素的影响。对于儿童、老人、孕妇、肾功能损害患者等特殊人群，可以考虑通过及时的血药浓度监测调整用药剂量，提高治疗效果并防止并发症发生。

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仪器与试剂采用高效液相色谱(HPLC)法

测定血清华法林浓度，A西lent 1260系列HPLC仪(美国A矛lent公司)，色谱柱为Eclipse xDB—C8(4．6μm×250 mm，5μm，美国Agilent公司)，华法林对照品(美国Sigma公司，纯度>99％)，甲醇为色谱纯(美国TEDIA公司)，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。华法林的出峰时间为8 min左右，血清内源性物质对样品的测定无干扰，峰形良好。

好的 产品经理要有发现新项目的眼光，更要有增量老项目的技巧，华法林耐药系列项目相信必然是老树发新枝的上量好项目。