浅析体外诊断试剂稳定性研究

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内容提要：稳定性作为检测体系的关键技术指标之一，对体外诊断试剂的安全有效具有重要的指导意义。本文从诊断试剂上市前研究过程中涉及到的稳定性类型及相关要求方面，对其进行了阐述。
关 键 词：体外诊断试剂 稳定性

        体外诊断试剂稳定性的定义在GB/T 29791.1-2013 中有明确描述：体外诊断医疗器械在制造商规定界限内保持其性能特性的能力[1]。该标准中明确了稳定性适用的三种情形：一是适用于当体外诊断试剂、校准物或控制物在制造商规定的条件下储存、运输和使用时；二是按照制造商使用说明制备、使用和贮存的复溶后冻干材料、工作液和从密闭容器中取出的材料；三是校准后的测量仪器或测量系统，对体外诊断试剂而言，测量系统的稳定性通常用时间来量化。

        稳定性作为体外诊断试剂保持产品安全有效的重要指标，对产品的生产、运输、保存和使用等环节具有重要的指导意义。美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）在其指南EP25-A 中，对体外诊断试剂稳定性研究的目标、稳定性研究计划、稳定性研究过程路径，以及实时稳定性、加速稳定性研究方法等都作了详细的描述[2]。在附录中，还结合具体实例分析了测量漂移（Measure and Drift）、将加速稳定性实验数据用阿伦尼乌斯方程（Arrhenius Equation）推导产品保存期限，以及基于线性回归分析来确定稳定性研究中的时间点设置等。该指南为体外诊断试剂的稳定性研究提供了重要的技术参考。国家食品药品监督管理总局（CFDA）在2014 年9 月5 日发布的《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告（2014 年第44 号）》中，对体外诊断试剂的稳定性研究提出了明确要求：包括至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的实时稳定性研究资料，并应当充分考虑产品在储存、运输和使用过程中的不利条件，进行相应的稳定性研究；应当详细说明稳定性研究方法的确定依据及具体试验方法、过程[3]。下面结合体外诊断试剂研究中涉及的稳定性要求作如下分析。

1.实时/ 效期稳定性
        诊断试剂的实时稳定性对于确定产品的有效期具有重要意义[4]。实时稳定性研究应将至少三个批次的产品，按照制造商声称的条件，例如温度、湿度等，考察至预期的有效期后，按照产品技术要求进行全性能检测。在考察过程中，应结合产品情况，合理设置考察时间点，对环境影响敏感、保存要求较高的产品，建议增加相应的时间点，以及时了解产品性能。实时稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、研究所用试剂、仪器以及校准品和质控品的信息、具体的研究方法及评价指标、详细的研究数据以及结论。

2.加速稳定性
        对于体外诊断试剂而言，加速稳定性通常指在非试剂说明书中声称的储存条件下的稳定性考察。加速稳定性旨在考察试剂在特定的极端环境中，试剂的技术指标是否还在可接受的合理区间，以评估试剂的性能。通常情况下，考虑到大多数试剂中主要组成成分为蛋白类物质，在试剂实际储存温度的基础上，升高温度来考察加速稳定性是最常用的方式，即我们通常所讲的热稳定性。需要注意的是， 尽管加速稳定性试验是考察诊断试剂性能的一种常见方法，但是CFDA 仍然期望产品的稳定性结论是基于产品的实时稳定性研究数据。在CFDA 发布的众多体外诊断试剂行业标准中，通常提供了效期稳定性和热稳定性两种方式进行验证，但是均注明了热稳定性不能用于推导产品有效期，除非是采用基于大量的稳定性研究数据建立的推导公式。虽然加速稳定性研究结论不能直接用于声称产品有效期，但是考虑到试剂在运输和使用过程中可能遇到的不确定性，产品加速稳定性研究仍具有重要意义。

3.开瓶/ 封稳定性
        开瓶/ 封稳定性旨在考察试剂在正常使用条件下，外界因素对试剂性能指标的影响。对于很多生化类试剂而言，受空气影响较明显，比如含有NaOH 的生化类试剂，吸收了空气中的CO2，导至试剂中NaOH 的浓度下降，直接影响试剂分析质量；还原型辅酶I（NADH）、邻- 硝基酚-β-D-半乳糖苷（ONPG）以及其他部分发光底物等一些稳定性较差的物质，也会因暴露于空气中而影响测定效果[5]。对于免疫类试剂， 由于其主要组成成分为抗原、抗体和酶等蛋白类物质，此类试剂除与空气接触影响试剂的酸碱度外，微生物污染也是很重要的因素，因此对此类试剂进行开瓶稳定性研究是非常必要的[6]。另外，对于胶体金试纸条/ 卡，由于生产时的低湿度要求，在开封时直接吸收空气中水分，也必须对开封后使用期限有明确要求。通常而言，开瓶稳定性的研究建议考察三批次样品，按照说明书的操作要求，合理设定时间间隔，在不同时间点，按照试剂的技术指标，对其进行检测，以确定试剂的开封有效期。

4.复溶稳定性
        复溶稳定性主要是考察试剂盒中或者与试剂盒配套使用的干粉在规定条件下用指定的溶剂溶解后，是否影响试剂的性能。目前在临床实验室中，干粉试剂主要是用于质量控制和校准活动的干粉质控品和校准品。与液体试剂相比，干粉质控品有效期较长，稳定性好，另外，干粉质控品一般都是很多项目质控物的混合，能同时对多个项目进行质控，因此，好的干粉质控品对检测结果的质量有着非常重要的影响[7]。对于干粉试剂的复溶稳定性，一般要选择三个批次考察准确度、批内精密度和批间精密度等指标。在复溶条件的建立时，应充分考虑诸如温度、溶剂等因素，并严格按照复溶的要求操作，减少非产品因素导至的误差，保证质控结果和临床检验结果可靠和准确。一般情况下，粉末状态的产品均需要提供复溶稳定性的研究资料，除非是复溶后立即且一次性适用的产品，这种情况下对复溶稳定性不作要求。另外，对于有些产品而言，开封稳定性就是复溶稳定性，比如某些冻干粉，开封后即用缓冲液溶解，并按照说明书的要求进行保存，因此选择开封或者复溶稳定性中的一项进行研究即可。

5.样本稳定性
        样本稳定性的研究对于实验的成败也至关重要。很多试剂的检测对象为抗原抗体等蛋白质类目标物以及DNA 和RNA 等核酸类物质。如前所述，蛋白类物质易受温度变化以及微生物污染等因素影响，出现蛋白变性、沉淀或降解等现象。因此，应提供对样本的保存温度、保存时间、冻融次数等方面的详细研究资料。对于RNA 和DNA 这类核酸样本而言，也易受外界环境的干扰出现降解、断裂等情况。特别地，当使用组织标本时（如石蜡包埋的病理切片），经过化学试剂处理后，核酸序列的完整性容易遭到破坏。因此，也应对诸如保存时间及温度等进行研究[8]。另外，考虑到核酸分离、纯化以及保存对待测物的影响，应对核酸分离/ 纯化前样本稳定性和分离/ 纯化后核酸在储备液中的稳定性进行研究。

6.运输稳定性
        体外诊断试剂运输稳定性主要是考察试剂在实际销售运输过程中的各种条件，对诊断试剂性能的影响。目前进行运输稳定性主要有模拟试验和实际运输两种方式。在进行运输稳定性之前，应掌握试剂在实际销售过程中的运输情况，对于大多数试剂而言，在实际运输稳定性研究时，结合目前实际，选取终端客户最远端，充分考虑天气条件、货物转运周期及运输方式，将产品递送至目的地，在此过程中，实时记录温度和湿度等参数，在此条件下评估产品的性能。运输稳定性的研究建议结合目前监管部门对体外诊断试剂冷链管理的有关要求执行。对于模拟试验，运输条件的模拟应当基于对实际运输条件的了解，如运输时间、预温度和湿度等）。值得注意的是，对于不同类型的产品，影响运输稳定的因素各有侧重，比如胶体金试纸条类产品，只要保证密封良好，运输过程中湿度的要求可以适当放宽；对于核酸类试剂，必须要保证运输过程的温度要符合企业的要求。

随着大众医疗需求的不断提高，高质量的体外诊断信息，对于切实发挥临床诊断的指导作用具有重要意义，而体外诊断试剂的稳定是临床诊断信息质量的重要保证，因此，建议诊断试剂制造商重视体外诊断试剂的稳定性研究，按照法规要求，结合产品实际，规范、合理地开展研究工作，保证体外诊断试剂的安全有效。

参考文献
略

来源： 本文刊登于《中国医疗器械信息》杂志2017年第15期
作者： 徐加发1 蔡瑶2
单位：1 江苏硕世生物科技股份有限公司 （江苏 泰州 225300）
          2 江苏省食品药品监督管理局认证审评中心 （江苏 南京 210002）