体外诊断产品相关原材料（二）

心中u你

编者按

作者简介

                      奚苏静

《中国体外诊断产业发展蓝皮书》编委

海肽生物科技（上海）有限公司总经理

HyTest 全球战略发展团队成员

浙江大学，上海交通大学工商管理硕士

专注上游原料领域服务诊断产业十余载。

2011年开始筹办HyTest 中国全资子公司，经过数年的悉心经营，海肽生物已经成长为国内免疫诊断原料的领先企业之一。

抗原（antigen，缩写Ag）指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原分子表面的有限部位能与抗体分子结合，称此部位为抗原决定簇（antigen determinant）或表位（epitope）。因此抗原的抗原性主要决定于抗原分子的化学性质。如抗原为蛋白质分子，其抗原性可决定于其氨基酸序列或其空间构型。

抗原分子的B细胞决定簇大小不同，其最大表面积约为50～70mm约由4～6氨基酸残基或糖基组成。100个氨基酸残基多肽可有14到20个非重叠决定簇，由线状排列彼此相邻的氨基酸组成，故称为线性或连续性决定簇。而球蛋白是有三维空间的折叠肽链，故其大多数决定簇被掩盖在内部，可称为隐蔽性决定簇。只存在于其表面的决定簇可被免疫细胞识别，或与抗体结合者称为功能性决定簇（图）。组成这种决定簇的氨基酸，是由折叠的肽链将有同位置的氨基酸使之相邻成为有一定空间构型的决定簇，故称为构像决定簇或不连续决定簇。现已证明抗原分子的抗原性是由其组成的氨基酸予列、空间构型及其决定簇片段的移动决定的。

许多天然物质可诱导免疫应答，其中大分子蛋白质和多糖具有强免疫原性，小分子多肽及核酸也具有免疫原性。

1化学组成

大分子蛋白质，分子量大于10000者，可含有大量不同的抗原决定簇，是最强的免疫原。如异种血清蛋白、酶蛋白及细菌毒等，是强免疫原蛋白质的例子。

多糖是重要的天然抗原，纯化多糖或糖蛋白、脂蛋白以及糖脂蛋白等复合物中的糖分子部分都具有免疫原性。在自然界，许多微生物有富含多糖的荚膜或胞壁，细菌内毒素是脂多糖，以及一些血型抗原（A、B、C、H）也是多糖。

核酸分子多无免疫原性，但如与蛋白质结合形成为核蛋白则有免疫原性。在自身免疫病中，可见对天然核蛋白诱导的免疫应答产生的抗DNA或RNA抗体。

此外，多肽类激素如胰岛素虽为小分子量（6000）亦具有免疫原性。来自一种动物的胰岛素，如长期用于另一种动物，亦能诱导免疫应答产生抗体。

2分子量

凡具有免疫原性的物质，其分子量都较大，一般在1万以上，小于1万者呈弱免疫原性，低于4000者一般不具有免疫原性。许多小的免疫性原性分子可激发细胞免疫，而不产生抗体。亦有大分子量物质，如明胶分子量可达10万，但因其为直链氨基酸结构，易在体内降解为低分子物质，所以呈弱免疫原性。可见免疫原性除与分子量有关外，还与其化学结构相关。

3化学结构

在蛋白质分子中，凡含有大量芳香族氨基酸，尤其是含有酷氨酸的蛋白质，其免疫原性强；而以非芳香族氨基酸为主的蛋白质，其免疫原性较弱。蛋白质和多糖抗原，凡结构复杂者免疫原性强，反之则较弱。其复杂性是由氨基酸和单糖的类型及数量等决定的。如聚合体蛋白质分子较单体可溶性蛋白质分子的免疫原性强。

自发现抗体后，用血清学方法在体外实验，证明了天然抗原与其相应抗体发生特异性结合，这是一个重要的免疫学现象，称这种特性为抗原的抗原性。在早期由于尚未建立对蛋白质抗原进行分析的方法，为研究抗原性的化学本质造成了困难。奥地利免疫化学家Landsteiner在本世纪20年代创建了人工结合抗原，并应用血清学方法对抗原性的化学本质进行了系统的研究，为抗原、抗体的相互作用提供了大量知识，为天然抗原化学性质的研究奠定了基础。

抗原在诊断工业的用途，一方面是与前文抗体的用途相对，用来检测抗体如自身抗体、传染性疾病抗体等，另一方面广泛地应用于试剂盒的标准品、质控品和校准品的制备，对血液样本中的待测抗原进行定量。

抗原产品主要分为天然抗原、重组抗原、合成抗原等。天然抗原可取自动物组织、微生物培养物等，需经提取纯化才能使用；重组抗原是抗原基因在质粒体中表达的蛋白质抗原，多以大肠杆菌或酵母菌为质粒体。重组抗原的优点是除工程菌成分外，其他杂质少，而且无传染性，但纯化技术难度较大。重组抗原的另一特点是能用基因工程制备某些无法从天然材料中分离的抗原物质。合成多肽抗原是根据蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。多肽抗原一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子质量太小，往往难以直接吸附于固相上。多肽抗原的包被一般需先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接的结合到固相载体表面。

抗原性能的核心是对其在待测样本中存在形式的真实模拟。在工业生产中，抗原作为免疫原也决定了由其产生的抗体的关键性能，如特异性和灵敏度。不同抗原的比较如下图。

抗原作为主要的核心原材料，对于整个免疫检测分析系统有着至关重要的影响。除去试剂制备工艺外，抗原自身的性能可在很大程度上决定着检测试剂的质量。目前，衡量抗原质量的技术指标没有统一标准，但是可以大概总结为生物活性、纯度、批间差、稳定性等。

抗原的生物活性首先要求该产品与临床样本中的天然抗原具有高度一致的免疫化学特性，除了具备相同的氨基酸残基数、相同的分子量，还需要有相同的空间构象和修饰。为获得优质的抗原，原料生产厂家往往需要先对样本中天然抗原的存在形式进行深入研究，如微生物致病株的特异性抗原表位、人体内天然蛋白在临床样本中的存在形式、在检测体系中存在的干扰因素等等，从而设计该抗原的研发和生产路径——进行天然提取或重组、合成；采用原核细胞或真核细胞表达；以游离形式或多聚体形式甚或带有载体；甚至产品以冻干粉、冻液或液体形式交付，都可能影响抗原的生物活性，需经过原料厂商严谨细致的反复验证。

关于纯度，与抗体一样，当抗原作为原料用于检测抗体时，往往需要先将抗原进行修饰，当抗原纯度不够时，会导至其他杂蛋白被一起偶联于固相介质或者标记物上，从而影响了试剂的反应性能，如特异性、反应信号、背景值等。抗原的纯度测定主要有SDS-PAGE电泳后的条带扫描和HPLC测试等。

重复性/批间差，是指每批次产品的可重复性。重复性则是保证体外诊断试剂降低批间差异并且稳定生产的前提条件。另外，如前所述，重复性和生产工艺密切挂钩，因此也是体现抗原质量的关键指标。

稳定性是指在特定的储存条件下，一定时间内抗原保持其活性的能力。抗原不像抗体那么稳定，为保持抗原的稳定性，多数供应商提供的抗原的储存条件为-20℃或-70℃，或4度储运的冻干粉，并强调抗原稀释分装后应冷冻保存。而抗原制备产品的稳定性由含各种保护成分如BSA、尿素、或商用蛋白稳定剂保驾护航，该类Buffer往往也成为诊断试剂公司秘而不宣的核心竞争力之一。

采购抗原制定质量标准时，一般重点包含以下几个方面：

性状：澄清均一的液体或溶解/复溶后为澄清均一的液体，不应含有异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒。（部分抗原天然存在微白或浑浊现象，厂家一般有说明）

纯度与分子量：纯度标准按需设定，纯度越高价格越高；采用SDS-PAGE凝胶电泳确定纯度与分子量。

生物安全性：人源抗原务必要求原料供应商确保HBsAg、HCV、HIV、TP呈阴性。

效价和功能性实验：建议试剂厂商与原料供应商协商确定基准批次，对新批次的功能性实验以与基准批次的平行对照结果为依据进行验收。

1. 酶

2.1生化酶

酶是体外诊断工业的重要原料，是临床化学和分子诊断的核心原料，也是免疫诊断中酶-底物信号体系中不可或缺的成分。本小节主要介绍作为临床化学核心原料的生化酶和作为分子诊断核心原料的分子诊断酶、引物、探针及相关产品。

酶是生物催化剂，是由组织细胞合成的、具有生物催化功能的蛋白质（少数是核酸），对化学反应有强的催化性，对底物有极高的选择性（包括对底物的种类，底物的区域，位点和立体的选择性），一种酶只能够催化一种底物的一种反应，反应的转化率和产率很高，几乎没有副反应。酶的特性使得其在临床检验，化学分析和特定产品生产上优势远远超过其他化

学方法。人体内只有酶存在才能进行各项生化反应，所以人体内的新陈代谢和酶的催化息息相关。一般来说，健康人体内酶活性和酶量相对恒定，当人体某些器官和组织发生病变时，特定的酶被释放入血、尿或体液中，与之相关的酶量或者活性会发生相应的变化。例如，当胰腺发生急性病变时，脂肪酶大量释放入血，其血清表达水平和胰腺炎病情严重程度有一定的相关性，早期检测血清脂肪酶可以较好地区分急性和非急性胰腺炎。因而使用相应的工具酶检验试剂盒等诊断工具测定血、尿或体液内酶量或者活性变化，可以诊断某些疾病。

人类使用酶的历史源远流长。相传夏禹时期，我国人民就发明了酿酒，后来又开始用豆发酵做成酱油等，在公元前6世纪，我国已经开始用曲治疗肠胃病，这估计是人类最早将酶应用于疾病治疗。19世纪初，科学家们发现胃液可以消化肉块，植物提取物或者唾液可以将淀粉转化成糖，但是他们并不清楚具体是什么物质在起作用。法国化学家Louis Pasteur 在研究淀粉转化成糖，又经过酵母作用发酵成酒精的过程中，他提出这种发酵是由酵母中的一种活性物质催化的，他将这种物质称之为酵素（ferment）。现在日语中酶就是“酵素”二字，一些欧洲国家仍然沿用了酵素一词，立陶宛有一个做酶的公司名字就是Fermentas，后来被Thermofisher收购。1878年，德国生理学家Wilhelm Kühne第一次将这种物质称之为Enzyme，源于希腊语：ενζυμον，意为发酵中，用来描述这个催化过程。1926年，美国科学家J.B.Sumner从刀豆中提取出脲酶，并证实脲酶其实是一种蛋白质。20世纪30年代，科学家们相继提取出多种酶的蛋白质结晶，并指出酶是一类具有生物催化作用的蛋白质。后来科学家们又发现有一些RNA具有酶催化活性，称之为核酶。所以确切的说，绝大多数酶是蛋白质，有些酶是核酸和蛋白酶的复合体，少数酶是核酸。

1961年国际酶学会（IEC）根据酶催化反应的类型将酶分为六大类，制定了系统命名法，规定每一种酶只有一个系统名称和系统标号，系统标号由四个数字组成，如脂肪酶的系统标号为 EC 3.1.1.3。六大类酶主要是催化反应性质不同，催化氧化还原反应的酶称为氧化还原酶类，包括氧化酶和还原酶；催化底物之间进行某些基团的转移或交换的酶类称为转移酶类，如转氨酶，葡萄糖转移酶等；催化底物发生水解反应的酶类称为水解酶类，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶等；催化从底物移去一个基团并留下双键的反应或其逆反应的酶类称为裂解酶类，如脱水酶、脱羧酶，醛缩酶等；催化各种同分异构体、几何异构体或光学异构体之间相互转化的酶类称为异构酶类，如异构酶、消旋酶等；还有合成酶类，如DNA连接酶，tRNA连接酶等。

1961年国际酶学会规定了酶的活力单位：1个酶活力单位是指在特定条件（25℃，其它为最适条件）下，在1min内能转化1μmol底物的酶量，或是转化底物中1μmol的有关基团的酶量。因此，酶的活性就是酶的催化能力的大小。测定酶活性的方法有很多，不同的酶生产厂家也使用不同的方法测定酶的活性。国际临床化学联合会（IFCC）和各国家级协会推荐的酶活性测定的标准化参考方法是连续监测法，即用适当的仪器连续检测整个酶促反应中的底物消耗或者产物的生成量，一般是每十五秒到一分钟检测一次，随着时间变化可以求出酶促反应速度。

酶的活性中心（active center）是酶蛋白构象的一个特定区域，只是酶分子中的很小部分，能与底物相结合并催化底物转变为产物。酶蛋白分子上只有少数氨基酸残基与催化作用有关，大部分氨基酸残基并不与底物接触。酶的活性中心具有特定的三维空间结构，或为裂缝/凹陷，多为氨基酸的疏水基团组成的疏水环境。

酶作为具有特殊性能的生物催化剂，受到学术界与工业界高度重视。据统计，酶制剂全球产值约为100亿美元，市场潜力大概在千亿美元，酶的品种和应用正处在快速增长阶段，年复合增长率超过10%。人们于20世纪初开始将酶应用于临床诊断，到现在已经有一百多年历史。1900年，人们发现血清脂肪酶活性的升高对于急性胰腺炎有特异的诊断价值，1904年 Wohlge-muth 记述了急性胰腺炎病人的血清与尿中淀粉酶活性升高。1959年Karmen，La Due Wroblewski等人先后证实转氨酶对肝炎和心肌梗死有诊断价值。后来学者们针对人体特定组织器官如心脏、肝脏、肌肉、肾脏、血液等发生病变与重要代谢酶的关系做了研究，并且确定了这些特定组织器官发生病变时与病人血中酶活性变化的关系。

我国人民使用酶的历史虽然悠久，但是因为工业发展相对发达国家滞后，酶工业化快速发展是近几十年的事。虽然我国人民将酶用于疾病治疗有上千年的历史，但是诊断酶学的研究却开始于20世纪30年代，发展到80年代后，工具酶检验试剂盒开始生产和普及，并且引进自动和半自动生化检测仪，在血液生化成分如血糖、血脂等酶法测定，还有其他体液酶和同工酶方面的检测都得到了大幅度的发展。

体外诊断试剂又被称为“医生的眼睛”，其质量水平影响到临床诊断的准确性和速度，进而一定程度上影响疾病的治疗效果。而酶诊断方法可靠，便捷，所以在临床诊断上得到广泛应用，一方面根据体内与疾病有关的酶活性变化来诊断某些疾病，例如测定转氨酶活性变化来诊断肝病；另一方面利用酶来测定体内与疾病有关的物质的量来对疾病进行诊断，例如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量来诊断糖尿病。

迄今为止，应用于诊断的酶类达多100多种，在医院检验科中应用诊断酶量最大的是常规的生化检验，例如：肝功，肾功，心肌酶和血脂，这四项又统称为大生化，其中有诊断价值的酶有12-15种。

表4.9-3，13种酶与疾病的关系

随着酶工程技术的发展，人们将葡萄糖氧化酶，葡萄糖脱氢酶，尿素酶和胆固醇酯酶等制备固定化酶，应用于生物传感器/POCT，用于测定血糖、尿酸、胆固醇的测定，检测方法更加便捷，方便。

目前，酶标免疫技术在临床诊断得到广泛应用，首先将酶与抗原抗体相结合，制备成酶标记的抗原或抗体。测定时，利用酶标抗体（或酶标抗原）与待测样品中的抗原（或抗体）相结合，再借助标记的酶催化特定反应，测定出在酶-抗体-抗原结合物中的酶的含量。通过抗原抗体的量可以诊断某种疾病。在酶标免疫测定中，最常使用的标记酶是辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP。碱性磷酸酶AP一般有两种来源，一种是从牛肠中提取的（Roche和BBI Solutions 可以提供牛肠中提取的AP），一种是微生物来源的（Roche和Sekisui Diagnostics 可以提供微生物来源的重组AP）。利用酶标免疫测定，可以诊断肠虫、毛线虫、血吸虫等寄生虫病，以及疟疾，麻疹，乙型肝炎等疾病。

目前，国内体外诊断生产企业采购的诊断酶原料主要依赖于进口。诊断酶的主要供应商为Roche，TOYOBO，Sekisui Diagnostic（原Genzyme Diagnostic），AsahiKASEI，BBI Solutions等。近几年，因为生化诊断市场竞争趋于红海，为了控制上游成本，有些诊断企业开设原料研发部门，生产出的原料酶应用于内部生产，从而控制成本，控制原料质量，控制上游原料供应风险。

一般体外诊断生产商需要采购大量的诊断酶作为原料，由于生物体内酶的含量低，不能适应工业化生产的需要，酶的生产厂家很多采用微生物的发酵来制取，在适宜的条件下，选育出所需要的菌种，让其进行繁殖，通过发酵工艺获得大量的酶。

酶发酵工艺图示：

2.2 分子诊断酶、引物、探针等

近年来，全球分子诊断市场增长快速，复合增长率高达11%，是体外诊断产业中增长最快的领域，也是未来最有潜力的发展方向之一。本小节主要对分子诊断产业链上游原料展开分析。诊断酶、引物、反转录酶和探针等是分子诊断上游的核心原料，目前国内分子诊断企业原料采购主要依靠进口，国际上分子诊断核心原料供应商主要有Roche （KAPA systems），Thermofisher（Life Tech，ABI，Invitrogen etc.），Qiagen（Enzymetics），Meridian Life science，Sekisui Diagnostics（Former Genzyme Dianostics），Takara（Clonetech Labs）等，随着国内生物技术的快速发展，国内的分子生物学生产企业（例如：菲鹏，近岸蛋白等）也陆续开发出应用于分子诊断的酶。

分子诊断技术主要是聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction简称PCR），核酸分子杂交技术和生物芯片技术。其中，PCR产品占据分子诊断领域的主要市场。  

聚合酶链式反应原理凭借灵敏度高、特异性强、快速诊断的特点荣获93年诺贝尔化学奖，由于PCR可以进行定性、定量检测，因而可广泛用于遗传病基因、肝炎、细菌、病毒和肿瘤等检测。因PCR在病原体检测方面的独特优势，成为分子生物学诊断的主流。参加PCR反应的物质主要有五种，分别是Taq DNA 聚合酶、引物、dNTP（dATP， dCTP, dGTP, dTTP, dUTP）、模板和缓冲液（其中含镁离子）。PCR反应中，DNA高温时变性解链，低温时又复性成双链，设计引物作为启动子，同时变化温度控制DNA的变性和复性，加入DNA聚合酶和dNTP就可以完成特定基因的体外复制。在扩增目的基因的过程中，温度变化从50-90度，变化很大，然而DNA聚合酶不耐高温，每次循环需要重新加入新的DNA聚合酶，用量大成本高，操作繁琐，制约了PCR技术的进一步发展。1973年我国台湾科学家钱嘉韵从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中成功分离出了耐高温的Taq DNA 聚合酶，简称Taq酶。该酶90度高温不失活，不需要每次循环重新加入新的酶，大大简化了PCR技术，降低了成本，使得PCR技术广泛应用并进一步应用于临床诊断。    Taq酶主要分为三类，高特异性Taq酶，高保真Taq酶和高耐热性Taq酶。高特异性Taq酶的代表是热启动Taq酶，是必需经过高温才能启动的酶，在初始循环变性前热启动Taq酶没有活性，不会产生非特异扩增，大大提高了PCR扩增的特异性。目前企业常用的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶，如Qiagen公司的HotStar Taq酶，Sekisui Diagnostics公司的HS Taq 酶等，真正实现便利的热启动，无需别的辅助抑制物，使用更加方便高效。

分子诊断对PCR高保真性要求很高，错配率是检验高真性的一个标准，错配率越低高真性越高，高保真Taq酶具有3’-5’核酸外切酶的活性，错配途中可以切掉错配的碱基，保证了扩增的准确性。目前市场上使用的高保真酶主要有两类，一类是TAKARA（Clontech）公司生产的混合型高保真酶，就是将带有Proofreading活性的酶与普通Taq酶混合。另一类是单一型的保真酶，具备更高的保真性，如Qiagen公司的ProofStart DNA聚合酶，NEB公司的Vent DNA聚合酶。NEB公司还提供高耐热性Taq酶，如Vent和Deep Vent DNA聚合酶系列，对于有些模板变性温度较高，需要时间较长，就需要此类高耐热性Taq酶。

几乎所有的Taq酶都带有相应的反应缓冲液，缓冲液的品质对保证Taq酶特异性扩增起的作用不容小觑。目前生产厂家一般有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提取的天然酶，一种是大肠杆菌合成的基因工程酶。一般来说一个典型的PCR反应，所需要的酶量是2.5U（总反应体积为100ul）。浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

实时荧光定量PCR是聚合酶链式反应（PCR）广泛应用的一种变形。实时荧光定量PCR通过荧光染料或者荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，最后结合相应的软件通过标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR可以实时定量检测致病病原体基因核酸，一般来说，它比化学发光、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

实时荧光定量PCR标记的方法有内掺式染料（荧光染料SYBR Green I），序列特异性探针（Taqman Probe）和引物特异性探针（Amplifluor Probe）。SYBR Green使用方便，不必设计复杂的引物，成本低，灵敏度高，可以用于不同的模板，没有序列特异性。Taqman探针对目标序列有很高的特异性，所以特别适合SNP检测，目前应用非常广泛。与普通PCR相比，实时荧光定量PCR全程监控，定量准确，引物和探针同时与模板特异性结合特异性高，荧光检测灵敏度更高，无需跑胶自动化程度也更高。

诊断酶作为体外诊断生产商的核心原料，对于生产成本，产品质量和稳定性有着决定性的影响。由于诊断酶技术门槛高，自主研发难度大，目前体外诊断生产企业主要进口诊断酶，国际上主要的诊断酶生产厂家都有几十年的历史，酶产品质量稳定，批间差小，但是存在价格高，货期长等弊端。酶作为特殊蛋白质维系生命过程，所以酶的研究对生命科学发展非常重要；酶作为生物催化剂在各个领域被广泛应用，尤其是在医疗诊断尤其是在临床诊断领域的应用，对提高人们的健康生活水平具有重大意义。

未完待续...

来源：CAIVD

buguniao3039

对于刚进入这个行业的人来说，受益匪浅，感谢

oyitre

谢谢分享，好好学习