液体活检标本采集容器的选择与应用

长长的路

近几年我国分子诊断技术的发展迅速，尤其是新一代测序技术（NGS）在无创产前基因检测（NIPT）、人类遗传基因检测（HGT）、循环肿瘤细胞（CTC）基因分析以及其他疾病诊断方面已经得以广泛应用。保证检测结果的准确、可靠除了需要精密的仪器、优良的诊断试剂，用于这一类高精度分析检测的标本采集容器的质量也不可忽视。


液体活检是指利用高通量测序技术来检测人体体液标本中的核酸（包括DNA、RNA、cfRNA、miRNA、ccfDNA）对遗传、生殖、外来侵入等进行定位、研究和监控，为临床和科研提供辅助诊断依据。目前应用较为广泛的利用NGS检测血液循环游离DNA（Circulating Cell-free DNA，简称ccfDNA）的分子诊断技术，就是通过捕获存在于血浆中的循环游离DNA进行测序，为精准医疗提供重要的诊断依据。只要血液中存在“外来”DNA，如来自胎儿的DNA会经过胎盘进入母亲的血液；人体肿瘤细胞、凋亡细胞或者移植器官等的游离DNA也会进入血液循环，均可利用液体活检技术进行检测。鉴于ccfDNA的性质，这种游离DNA可能难以定量，对于健康个体，它的产量大约在4ml血浆中1-100ng这个范围。若是研究对象处于各种疾病状态或是女性处于孕期，则ccfDNA的浓度会远远超出这个范围。血液标本在采集后如果没有合适的储存容器、合理的提取纯化过程，往往会导至血液细胞内的基因组DNA（gDNA）释放到血浆中，对ccfDNA造成稀释，导至检测结果的偏差；由于ccfDNA含量极少，如果采集容器的稳定剂不能消除DNA分解酶（Dnase）或者血液受到细菌等微生物污染也会导至结果偏差；另外，一些血液采集容器的添加剂（如抗凝剂、稳定剂等）会对DNA有修饰作用，造成ccfDNA峰位移，更会导至检测结果偏差。因此，要想液体活检真正做到精准，选择合适的采集容器是至关重要的第一步。

目前，用于分子诊断的标本采集容器除了血液采集容器（真空采血管）以外，还有唾液采集容器、口腔粘膜细胞采集器、尿液采集容器、粪便采集容器、痰液采集容器、宫颈细胞刷、鼻咽拭子、脑脊液采集容器、骨髓采集容器、病理组织保存容器、血液采集卡、DNA样本存储卡（FTA卡）等等。其作用主要是采集并稳定样本中的核酸，而核酸分为DNA和RNA，DNA存在于细胞核中，RNA存在于细胞质。如何让这些既微量又珍贵的信使保持原始性、纯洁性呢？一是标本采集容器本身应洁净没有污染；二是采集容器的添加剂应能保持样本内核酸的稳定并耐受一定温度影响；三是采集容器应密闭、耐压，可以适应长途运输；另外，采集容器的添加剂不能过度稀释标本，也不能对后续的核酸提取纯化造成不当影响。现在市场上各类标榜可以用于液体活检的标本采集容器五花八门，品质良莠不齐，往往鱼目混珠。比如用于NIPT（无创产前基因检测）的循环游离DNA采血管，市场上售价在10元-100余元价格不等，多数没有经过药监部门的注册审批，有的进口产品既没有取得生产国的产品注册市场准入，也没有我国药监部门的进口许可；还有一些生产厂家的产品只有单一的抗凝剂，并没有核酸稳定组分或者稳定剂配方不合理，多数产品在应用核酸蛋白检测仪对样本提取的DNA进行检测时发现A260/A280小于1.7，说明DNA的纯度不高；还有的采血管内的试剂严重修饰DNA，应用生物分析仪进行测定时发现，ccfDNA峰位移严重，造成样本检测数据失真；更有甚者，有的采血管已经被微生物污染，根本无法分离出属于人体的纯净DNA。因此，选择ccfDNA采集管时应注意以下几点：采血后不能有标本溶血，以防止gDNA释放稀释ccfDNA；采血管内的稳定剂应能够抑制或消除Dnase，以防分解ccfDNA，降低检出率；采血管内容物不能被细菌污染，以防DNA失真；采血管的添加剂组分不能修饰DNA，造成ccfDNA峰位移；采集容器应具备密闭性并有一定强度，以免造成运输破损；添加剂不能过度稀释标本，也不能对后续的提取纯化造成不当影响，更不能影响下游试验。另外，用于临床诊断标本采集的的真空采血管还应取得合法的医疗器械产品注册证。

使用者在选择了质量合格的采集容器以后还应注意以下问题：一是要严格按照生产厂家的使用说明书正确采集、分离、储存、运输标本，必须清楚不同采集容器的分类及用途。比如用于核酸提取纯化或下游试验的核酸类采血管主要包括血液RNA管、血液DNA管（这两种采血管用于稳定基因组RNA或DNA，最终使用的样本是全血）；血液cfRNA管、血液ccfDNA管（这两种采血管用于稳定游离RNA或循环游离DNA，最终使用的样本是血浆）。用于基因组核酸采集保存的血液RNA管和血液DNA管在采血管后应充分混匀，在室温平衡不少于2小时，不多于72小时，可以转移至-20℃保存。若需转移至-70℃或-80℃保存，则需要在-20℃冻存至少24小时再转移。如果采集后需要立即运输至异地，则应注意标本的运输时间在室温下（15-25℃）可以稳定3天，2-8℃稳定5天，但超过35℃不应多于24小时，最高运输温度不能超过40℃。对于血液cfRNA管和ccfDNA管应注意采集过程中不能有溶血，采血后充分混匀，可以立即分离血浆（注意尽量使用水平离心机，离心力1900g，离心时间10分钟），也可以室温（15-25℃）保存或运输（温度不宜超过35℃）7天内再分离血浆，在吸取血浆时应注意不要吸入血浆下层的血液有形成分沉淀。如果采集后立即分离血浆，可以冻存后复融再二次离心。

二是如果需要提取纯化核酸则要选择合适的试剂盒。目前，市场上销售的核酸提取试剂主要包括盐析沉淀法、硅膜吸附法和磁珠法。由于不同厂家生产的标本采集容器所使用的添加剂并不相同，试剂中的一些组分在提取纯化过程中可能会形成干扰。因此，最好使用同一体系（采集容器与提取试剂配套），以获取最佳效果。

三是任何匹配性试验都要经过合适的验证过程，以判断标本采集容器提供的检体样本是否完全适合下游的试验。如肿瘤循环DNA检测需要提取的ctDNA（Circulating Tumor Cells DNA）本身含量就少，只占循环DNA总量的1%-0.01%，如果采集保存不当，就会出现检测数据失真。

总之，液体活检技术的应用可以促进医疗技术的发展造福人类，需要多个细分行业的充分配合，应充分整合资源促进技术进步，推动精准医疗的实现。


来源：小桔灯网   作者：朱德新，力因精准医疗产品（上海）有限公司