免疫层析--也来谈谈胶体金

笑看风云

如果说胶体金免疫层析，估计大家都不知道。如果说，早早孕，那大部分人都会，oh，两条杠啊。放图：


这就是早早孕试纸条，纯洁的小朋友也不用害羞，这是科学讨论，早早孕是胶体金免疫层析试纸条里的明星，适龄青年基本均略有耳闻，更有甚者耳熟能详。小编就是耳熟能详的的那一类人，不要误会，小编也只是研究它而已，天天和此技术打交道，做的是病毒检测······，是的，艾滋病毒检测，怕了吧。

20世纪90年代末，胶体金标记被引入膜快速检测中，在适当生产条件下，任何精确大小的金颗粒都可以被重现性制造出来。不同的大小可用于不同的用途。当胶体金被大量生产时，为了保证重复性和稳定性，成熟的方法和工艺是必须的。为了获得粒径均一且单分散型的胶体，目前市面上合成胶体金的有很多种，尽管所有方法都是依赖于还原HAuCl4来形成金原子，但其物理条件还是有相当大的差异。通常使用的还原剂有柠檬酸三钠、黄磷、硼氢化钠、硫氰酸钠等。

那现在就来谈谈小编的经验了。
第一，需要保证器皿的洁净度，通常情况下，会对所有需要接触到胶体金的器皿使用王水或重铬酸钾洗液浸泡过夜，使用纯净水冲洗干净后，多次使用高纯水冲洗，再烘干，此时的器皿就是洁净的且不含任何阴阳离子了。有部分科研人员会对器皿进行硅化处理，在器皿表面镀上一层硅，使用5%的二氯二甲基硅烷对玻璃器皿进行浸泡处理后烘干，即为硅化处理了，此方法同样是为了防止玻璃器皿内残留的阴阳离子对实验造成影响。

第二，就是制备胶体金了，我们实验室使用的是柠檬酸三钠，又称鞠酸化钠，相比于其他的还原剂，它安全可靠且稳重。常规的制备方法是：配置0.01%的氯金酸水溶液，封住容器口，搅拌子搅拌混匀加热，直到接近沸腾的温度时，一次性加入一定体积的1%的柠檬酸三钠溶液，保持低速搅拌（尽量降低液体蒸发速度），继续加热，可见反应容器内液体由淡黄色-淡紫色-黑色-酒红色。最后达到稳定的酒红色后，继续加热5min，关掉热源，冷却至室温，即为制备好的胶体金。操作所有过程，使用的都是高纯水。

第三，1%柠檬酸三钠的体积与0.01%氯金酸的体积的比例不同，制备出的胶体金的粒径也不相同。常规的1.5mL/100mL可制备出的胶体金的粒径在40nm左右，当然，这和每个人配置的试剂浓度标准性也有关。随着还原剂体积的增加（也就是柠檬酸三钠溶液体积的增加），制备所得的金原子的粒径会越来越小。通常情况下，制备了胶体金后，我们会通过电镜扫描确定所制备得到的金原子粒径大小及均一度。



下面是胶体金形成过程介绍图：

大体来说，就是还原剂提供给溶液中带正电荷的金离子而产生金原子：
氯金酸+还原剂=胶体金
HAuCl4+e-=Au0

加入还原剂之前，溶液中所含为100%金离子。曲线的纵坐标代表加入还原剂后金粒子转化成为金原子的过程。加入还原剂后，溶液中金原子的含量立刻出现急剧上升，直至达到饱和。紧接着在一个被称为核化的过程中发生凝集作用，在核化位点形成由11个金原子构成的二十面体金核心。金原子可以沿着金核心聚集，长成不同粒径的胶体金。最初形成的核数目，决定了最终将有多少颗粒形成于溶液中，而此数目又反过来取决于所加入的还原剂的量。还原剂越多，产生的晶核也越多从而产生的金颗粒也越多。

显而易见，在一个含既定数目氯化金的溶液中，形成的核化位点数目越多，最终形成的每个金颗粒的尺寸就越小。因此，微粒大小可通过所加入的还原剂的量来精细调控。当条件通过优化，所有的核化位点都可以在瞬间同时发生，从而使得所形成的金颗粒大小完全都一致（单分散型）。一般情况下，还原可以瞬间发生，而核化要同时瞬间发生是很难的，这就导至生产均一度高的胶体的难度。

若在还原过程中核化作用及形成速度没有得到很好的控制，粒子的形成就会不均一，所见粒子可能有不同的大小和形状（椭圆、三角形、长方形、棱形等等）。这样的粒子在后续使用中，影响蛋白的结合过程，也不能在溶液中均匀分布，最终影响产品的颜色、敏感性、特异性和稳定性。一般胶体金的好坏与否，通过电镜能得到最直观的结果。不过也可从胶体金溶液的形态上辨别。“劣质金”溶液一般会显得浑浊，颜色不透亮。与之相对应的均一度较高的胶体金，通常颜色透亮，对光有丁达尔效应。

与代表着制作精良的40nm的单分散性胶体粒子的樱桃红色相比，由“劣质金”所形成的信号可见到淡蓝色或紫色。随着时间的推移，蛋白很容易和胶体金分离，导至假阳性或者背景变高。因此，为了制备更高质量的胶体金溶液，相关学者都在不断的进行一系列的研究。目前比较适用的就是回流加热煮沸法制备胶体金：
第一、同样是对反应过程的所有器皿进行王水或者洗液浸泡，或者硅化处理。烘干后，用高纯水浸泡，再次烘干。
第二、配置0.01%的氯金酸溶液，加入干净的搅拌子，混匀。
第三、回流圆底烧瓶放置于油浴磁力搅拌器内，加热至溶液接近沸腾。迅速的一次性加入一定体积的柠檬酸三钠溶液，继续恒温回流，保持沸腾状态。
第四、观察溶液颜色变化，由浅黄色—黑色—紫色—酒红色，颜色稳定时，低速搅拌。停止加热，冷却至室温，即为制备得到的胶体金溶液。

通过此方法制备得到的胶体金溶液，可以降低因为溶液蒸发造成的粒径不稳定性因素。剪了一段胶体金制备的操作视频，大家可以参考一下。

除了上述小编提到的两种方法以外，还有无数种制备胶体金的方法，因为小编没有试过，也就不再介绍，感兴趣的小朋友可以查阅相关文献后，进行尝试。欢迎投稿告知其中的不同及优势。旨在交流，欢迎发声！

来源：易微升

daniel

没看到视频哦

小金鱼

怎么说呢，接近沸腾是多少温度，如何控制

amanda燕尾蝶

微波煮金：0.01%氯金酸高火煮沸，加入1%柠檬酸三钠中火反应，完成
优点是操作简单的很，缺点是批次之间的质量控制

SPHERE-MFCIS

部分情况下可以考虑反滴法烧金，个人烧的效果还是不错的，批次差异会比正向低一些，温度控制方面，并不一定要去追求控制，个人建议更多的去追求统一性和易控性

七里香

SPHERE-MFCIS 发表于 2018-1-9 16:53
部分情况下可以考虑反滴法烧金，个人烧的效果还是不错的，批次差异会比正向低一些，温度控制方面，并不一定 ...

你好请问什么是反滴法？

SPHERE-MFCIS

就是加入柠檬酸钠和氯金酸的顺序