细菌内毒素

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细菌内毒素

细菌内毒素　

细菌内毒素，英文称作Enolotoxin，是G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。内毒素的主要化学成分为脂多糖中的类脂A
　　细菌内毒素这个概念在1890年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引成的，1933年Boivin最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到1940年时候，Morgan使用志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了1950年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。
　　细菌英文叫Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为G+菌和G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。唯有肽聚糖为其共同成分，但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见上图表
　　细胞壁较薄，厚约10－15nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生10％左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。
　　（1）脂蛋白（lipoprotein） 由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上，另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸 残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。
　　（2）外膜（outer membrane） 是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。
　　（3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 由多糖O抗原、核心多糖和类脂A(lipid A)组成（图1-8），位于最外层。多糖O抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。
　　细菌内毒素即：许多病原性细菌所产生的毒素。
　　一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。加一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。
　　细菌内毒素的生物活性：
　　1、致热性。2、致死性毒性。 3、白细胞减少。4、Shwartzman反应。5、降低血压，休克6、激活凝血系统。7、诱导对内毒素的耐受性。8、鲎细胞溶解物（鲎试剂）的凝集。9、刺激淋巴细胞有丝分裂。10、诱导抗感染的特异性抵抗力。11、肿瘤细胞坏死作用。
　　细菌内毒素的量值（单位）
　　在80年代以前，所有研究内毒素的报道，毫无例外地使用重量单位表示内毒素的量，在鲎试剂建立后也同样以重量单位表示鲎试验的灵敏度。随着人们对细菌内毒素生物活性认识的提高，以重量单位表示的不科学性被揭示，即相同重量的内毒素，对于菌种来源不同，其生物活性相差很大。1980年美国学者Hochstein完成了将重量单位转化为内毒素单位的工作。当时美国内毒素参考标准品代号为EC-2，该品的家兔发热剂量ED50为1.04ng/kg，而与此同时美国食品药品管理局（FDA）批准的鲎试剂参考品为第四批，FDA邀请当时已获有鲎试剂生产许可证的制造商进行协作研究，采用EC-2与第四批鲎试剂参考品，求出两者的凝聚终点用ng/ml表示，四个实验室的56次单独试验结果，几何平均值为0.194ng/ml，FDA就此规定该值为EC-2的1个内毒素单位，EC-2的量值为5EU/ng。自1982年美国药典修订1980年（20）版首次收载的细菌内毒素试验，内毒素单位（EU）被正式引入，明确指出美国内毒素参考标准品每瓶含10000EU。
　　细菌内毒素的检测
　　细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分，当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为1至100EU/ml。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内毒素检测试验合格后才能使用。由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以半个世纪以来用家兔来检测热原，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。
　　1956年美国人Bang发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后Levin和Bang又搞清楚微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单﹑快速﹑灵敏﹑准确，目前已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。
　　在美国，鲎试验被称作为“细菌内毒素试验（Bacterial Endotoxin Test）收载于1980年20版美国药典。随后英、德、意、日以及中国相继在药典中收载了这一检查法。此后鲎试验逐渐替代家兔热原试验，但由于部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验。2005年版中国药典规定133个品种进行细菌内毒素检查法，并收录了2种细菌内毒素检查法：包括凝胶法和光度测定法两种方法。前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质（比色）法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。比色法又可分为终点显（比）色法和动态比色法。该方法灵敏度、精密度高。国内如厦门鲎试剂厂早在05年即有显色基质（终点显色）鲎试剂盒上市。