为什么你的液态活检产品不能将成本降低五千块

长长的路

这是一项给产业带来变革的技术。

本文将帮助你解决如下问题：

1）如何以更低的成本对癌症患者进行多个基因突变的检测；

2）如何增加产品的灵活性。

意义：

以血浆DNA为核心进行突变检测的液体活检正在替代组织活检来对肿瘤基因进行评估。血浆中提取出的ctDNA（循环肿瘤DNA）携带了肿瘤的突变信息，对血浆中肿瘤突变进行精确检测在早期筛查、预后判断、随时监测肿瘤动态、微小残留病灶等方面均有实际应用价值。

困境：

血浆DNA断裂为平均140bp-170bp的小片段，每毫升血液仅有几千个拷贝可用于扩增，在这几千个拷贝中，仅有含量较少的ctDNA可以用于肿瘤相关的诊断。近期基于胎离游离DNA的无创产前诊断取得了长足进展，使循环游离DNA的临床应用变得火热，但也提出了新的挑战，如ctDNA分析中位点的突变频率低，可变性强。

解决方案：

关于低频突变，现有技术已经可以分析已知突变，如数字PCR，但数字PCR在应用于没有突变热点的病人时受到限制。为解除此种限制，本期文章引荐一种基于带标签的扩增子的深度测序技术TAm-Seq（tagged-amplicon deep sequencing），可以对跨越几千碱基的基因组区域进行深度测序，敏感度可达到几个拷贝。技术流程如下图所示：

TAm-Seq技术流程图

技术流程：

1 为扩增片段化的DNA，设计引物以产生呈瓦片状覆盖目标区域的扩增子，扩增子长度150-200bp；

2 使用所有引物对多个位点同时进行预扩增，使原始样品分散为多个独立反应，捕获模板中的起始分子，减少测序错误和等位基因丢失；

3 在预扩增的基础上进行单位点扩增，富集特异产物；

4 再次进行PCR，给样品加上身份识别码，上机测序。

应用检测：

1 灵敏度与特异性检测：

设计48对引物，扩增TP53和PTEN全外显子区段，以及EGFR、BRAF、KRAS和PIK3CA的代表性区段，共覆盖COSMIC数据库中38%的点突变，使用该方法对47个卵巢癌患者的肿瘤组织石蜡样本进行DNA测序。TP53基因突变结果与Sanger测序结果完全一致，并且包含了Sanger测序未检测到的三个突变。

2 血浆DNA中肿瘤突变的无创检测：

先用数字PCR分析肿瘤特异性的突变，然后将TAm-Seq应用于癌症患者血浆DNA，七个病人均鉴定出4%-44%的突变比例。在一份复发的卵巢癌患者样本中鉴定出EGFR的一个新的突变。结果显示TAm-Seq与数字PCR法保持高度一致，相关系数可达到0.9 。

3 监测复发患者ctDNA突变：

追踪两位复发病人的血浆样本，第一位病例是复发卵巢癌患者，56岁，，使用四线药物卡铂和紫杉醇化疗六个周期，治疗结束后CT显示疾病稳定。12周后，病情恶化，然后使用五线化疗药物脂质体阿霉素。

第二位病例中，患者为复发卵巢癌，64岁，使用二线药物ECX（卡培他滨-表柔比星-顺铂）联合化疗6个周期，放射检查显示治疗中期与治疗结束时病情均稳定，但治疗结束后3个月病情恶化。

针对这两位复发病人，检测了TP53突变，TAm-Seq和数字PCR方法均检测出。卵巢癌患者血浆中的等位基因突变频率与血清标志物CA125临床诊断结果相吻合，在系统的治疗开始后大大下降，病情恶化时增加。

基因突变频率与血清标志物CA125临床诊断结果相吻合

4 监测转移性乳腺癌患者ctDNA：

病例为转移性乳腺癌病人，经历两周期化疗，对肿瘤组织进行全基因组测序鉴定出体细胞突变。选择其中10个突变位点，针对10个位点设计小于120bp的扩增子。

对患者进行为期497天的治疗中血浆追踪。患者刚开始仅使用表阿霉素，四个月后，CT显示病情恶化，换用紫杉醇化疗。10个突变在治疗时突变频率显著下降，化疗终止后，随着病情恶化显著升高。

展望：

晚期癌症患者，常在较大的基因组区域出现基因突变，筛查整个基因寻找突变可以指导用药。高通量测序使检测整个基因组成为可能，但整个基因组覆盖区域过大，产生数据量过多，大部分数据可能并非为临床所需，而且针对临床所需要的信息，其数据深度不够，有效性往往值得商榷。基于扩增子的方法为提高检测位点的数据深度提供了新的思路，尤其是针对血浆进行基因分析的无创方法。

TAm-Seq方法中，扩增子较短，允许对血浆DNA片段进行扩增；两步扩增法使多重扩增与多区域扩增成为可能；每个样本进行双重测序可避免PCR假阳性的出现；样本加标签使其可以混合测序，降低成本；用48个样本建库小于1天，节省时间成本。

监测肿瘤动态的个体化肿瘤方案常常使用探针，价格昂贵，而TAm-Seq成本较低且应用灵活。该方法不仅能用于鉴定ctDNA的多个突变，也可以用于分析具备异质性的肿瘤中包含的稀有突变，如细胞学样本、循环肿瘤细胞，更可以用于良性病变的早期筛查。对石蜡样本与活检样本的基因分析而言，TAm-Seq可作为一种性价比较高的辅助手段。

TAm-Seq结果可提供针对特定癌症的诊断信息。靶向药如PARP抑制剂、针对EGFR的酪氨酸激酶抑制剂，都可以用于1级浆液性卵巢癌的治疗。肺腺癌EGFR 18号外显子到21号外显子区域（约560bp）的突变，可以选择吉非替尼和厄洛替尼治疗。

TAm-Seq方法可以进一步优化，如怎样增加深度、如何避免假阳性、是否可以对稀有突变进行富集。

毕竟，技术总是在进步，可喜可贺。

来源：基因前沿