一文看懂“液体活检”在国内的发展现状

检验之星

2016年7月21日-22日，液体活检产业发展论坛在上海举办，来自学术、产业、临床的各位嘉宾分享了自己在液体活检领域的研究，交流了关于技术、政策、科技转化等多方面的展望。

液体活检领域“CTC、ctDNA、外泌体”三足鼎立

液体活检即液体检材，通常指血液、唾液、尿液等可以进行身体健康诊断的体液。此处液体活检特指用以检测癌症信息的血液。

基因改变是肿瘤产生与发展的重要原因，几乎所有癌症患者都携带有DNA突变。这些突变通常只存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞，因此为肿瘤组织的检测与跟踪提供了方便的特异性生物标记。种类繁多的突变位点及基因型也为肿瘤的精确诊疗提供了必要的信息。

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是游离于血液循环系统中的肿瘤细胞，是肿瘤细胞转移的重要方式，也是肿瘤患者术后复发的重要原因，同时还是激发癌症致死机制的重要因素。CTC作为肿瘤细胞，不仅包含肿瘤的DNA信息，同时还包含基因组、蛋白质组等信息，是研究肿瘤组织信息的丰富来源。

循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是游离于血液循环系统中的肿瘤DNA，是肿瘤细胞死亡后释放出的小片段DNA，主要来源为坏死的肿瘤细胞、凋亡的肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、以及肿瘤细胞分泌的外排体。

外泌体（exosome）是细胞经过外排的小囊泡，直径通常为几十纳米。肿瘤细胞释放的外泌体数量远高于正常细胞，并且通常包含DNA、mRNA等物质，因此不仅可以进行肿瘤DNA的检测，还可以mRNA对融合基因等通过ctDNA难以获取的信息进行检测。

液体活检的技术关键，寻找万分之一的梦想

目前液体活检的研发与应用集中在CTC与ctDNA上，外泌体获得的关注较少。无论是CTC还是ctDNA，其血液含量都非常少，并且背景嘈杂。因此在大量杂质中富集极少含量的CTC及ctDNA便成为了液体活检技术发展的关键。

CTC的富集与鉴别

CTC是存在于外周血中的细胞，同时血液中还有大量的有核细胞，包括血管内皮细胞、良性上皮细胞等。需要先将CTC与其他细胞分离富集之后才可进行鉴别与分析。CTC的富集技术主要有三种，物理法、抗体法以及芯片法。

物理法指利用CTC的直径、电性等属性进行分离，包括播磨筛、流体分馏等方式。物理法发展较早目前已被多家公司使用，但此方法准确度不高，因为并非所有CTC都表现出大直径、带负电的特性。因此漏检、误检的可能性较大。

抗体法指利用CTC表面特异性表达的分子通过抗性结合免疫磁珠等介质进行捕获，如强生公司CellSearch系统使用的EpCAM，格诺思博公司使用的叶酸分子等。抗体法的关键在于鉴别出CTC表面特异性表达的分子。因为肿瘤是高度异质性的，即不同肿瘤细胞的表达差异很大，因此仅通过一种分子进行捕获往往会漏检，或者只能针对某一种癌症的某一种分型进行检测。目前也有很多学者和公司正在开发使用多种抗体共同捕获的技术。

CTC芯片法指使用硅芯片构建微型管道控制单细胞依次流过影像筛查关卡，通过影像分析判定细胞是否为CTC后在下一关卡通过加热产改变管道内液体流向将细胞推入不同的分选管道。这种方式与抗体法相比可以降低成本，提高效率。目前还未有成熟系统出现，有部分公司正在进行研发。

ctDNA的检测

与CTC类似，ctDNA在血液中的含量同样很低，血液中同样存在大量背景cfDNA分子干扰检测，因此ctDNA检测的技术关键在于对微量目标分子的捕获与扩增，为后续分析进行准备。目前检测ctDNA的方法主要有两种，一是以定量PCR为核心的技术，包括ARMS、ddPCR等，一是以二代测序为核心的技术。PCR技术的优势是操作简便、成本较低、可以精确定量。二代测序的优势是其高通量可以对大量基因进行检测。目前两种技术国内均有公司在进行研发。

无论是PCR技术还是二代测序技术，其试验流程都包括样品处理、上机测序/PCR、结果分析。目前PCR及测序仪器由外国公司垄断，尤其二代测序仪近七成的市场都有美国公司Illumina占有。同时仪器的制造技术壁垒很高，是中短期内国内公司无法染指的领域。在这种情况下，我国的研发大多集中在上机前的样品处理及上机后的结果分析两个步骤。会上多家公司及实验室都分享了自己的样品处理技术，包括安可济的Firefly技术，海普洛斯的Cube-Seq技术，允英医疗的Allngs等。在数据处理方面，很多公司也分享了自己的大数据计划及部分成果，包括燃石医学、元码基因等，希望通过大数据收集整理厘清基因型与病程、用药等临床指标之间的关系。

液体活检的政策监管，发展与稳定的权衡

与早期的无创产前检测（NIPT）类似，肿瘤液体活检的检测项目并没有获得国家食药监总局的批准但已经被正常销售，正处于LDT状态。LDT指医学检验实验室自行研发、验证和使用的检测方法，通常仅在研发的医学检验实验室内部使用。LDT阶段是新兴检验方法在收到大规模认可及正式批准前的必经阶段，也是培养先进检验方法的生长期。

各国对LDT的监管是不同的，美国经过各方长期讨论出台了对LDT的监管指南，根据其风险进行分级与分期管理，允许部分产品作为商品出售；欧洲及日本并未对其进行明确规定，许多科研试剂和临床医学检验实验室自建检测项目已用于临床检测；而我国食药监总局并未对其明确表态，持默许态度。

我国对于LDT发展的需求远重于监管的需求，实验室或厂商积极推广并研发的项目都是市场前景广阔、需求急迫的项目，比如本次会议的肿瘤液体活检项目。肿瘤的精准治疗是广大人品群众迫切需要解决的问题，因此从经济效益出发民间的研发及资本投入十分活跃。若是贸然收紧监管势必会阻碍新技术的发展，然而过于放松的监管则有可能导至市场的混乱，只有恰当的管理能够促进行业健康发展。

来源： 医药魔方数据  作者：贾雅希 徐友界