单抗制备技术近十年来进展

笑看风云

从人类发明这个技术开始，单抗制备已经有37年的历史了，这37年以来，主流单抗制备的基本主线几乎没有什么改变，也就是下面这个流程：
    抗原制备
    动物免疫
    细胞融合
    克隆筛选
    克隆化（亚克隆）
    Large-scale生产、纯化以及鉴定

    但是不同的研究人员从不同的角度和细节对整个流程有了独到的视角，这里我简单地总结一下近十年以来的发展和前人的经验，基本都是站长自己道听途说，加上参阅一些文献总结出来的， 十年以前的技术革新择重点简要提一提。

    抗原制备进展

    抗原，基本上分三类： 蛋白、多肽和小分子化合物。

    一般的制备过程没什么好说的了， 主要说多肽和小分子连载体的事。 多肽和小分子因为免疫原性弱，所以必须连接载体才能诱发免疫应答。 最常用的基本上就是KLH, BSA,OVA和GST， 但是觉得近几年以来，用多肽复合抗原肽（MAP）的比较多。其原理是把多肽或小分子连在多聚赖氨酸的骨架上，而多聚赖氨酸因为其结构具有高度重复性，所以不会像KLH等载体一样使动物产生抗体，这样就不会浪废有限的免疫系统资源。 毛病是这种形式的抗原在制备成本上贵许多，我记得一个MAP的制备报价大约在1500元人民币左右。

    从获取方式来看，对于蛋白质类抗原，不仅可以重组表达（原核和真核）， 还可以直接从天然组织或细胞中分离。早期的时候人们经常干这种事，那是因为当时没有现在这么普及的分子生物学技术，很难得到重组蛋白。 但是最近20年以来，基本上都用重组蛋白了，重组蛋白生产技术非常成熟，而且生产也简单，容易扩大规模，但是慢慢地很多人意识到重组蛋白和天然的蛋白在结构上有时候有着极大的差异，所以不少人认为确实是天然蛋白免疫得到的抗体是最好的，有兴趣可以看看这篇文章：Generation and Characterization of a Panel of Monoclonal Antibodies Against Distinct Epitopes of Human CD146，一个典型的从天然组织中纯化出蛋白作为抗原制备单抗的例子。

    在抗原的形式上，也是各式各样，根据自己的需要有不同的喜好，大部份人都推荐接近天然构象的蛋白，即使是重组蛋白，buffer 也尽量gentle， 另一些人则喜欢跑胶然后切胶打动物，还有的转膜后剪膜免疫动物（这一个通常和从天然组织中纯化的方法联用）。 还有人喜欢用过表达的细胞或转化的细菌作为免疫原（当然也有全细胞或者细胞组份裂解液作为免疫原的，此乃后话）。对于做免疫组化用的单抗制备，则还有更特殊的处理手段。

    另一些人则认为，用DNA直接免疫也许更好。其方法是把cDNA连到真核表达载体中，然后直接注射动物，在佐剂的作用下载体就带着cDNA进入动物细胞，然后在动物细胞就有目的蛋白表达出来，这些蛋白从细胞释放出来后就可以引起免疫应答（整个理论还没有建立完整，一切都在YY中）， 这种方法免疫中，现在缺少有效的佐剂，所以免疫效果很难保证，不过在比较低的效价下，很多人也可以得到阳性克隆。

    说了这么多，还是很沮丧，虽然看起来选择很多，但是能真正用到工作中的选择并不多，有时候是条件问题，有时候则是成本和精力问题。第一个话题就写这么多吧。

    动物免疫

    动物免疫故事比较多，简单点说。

    实验动物的选择： 做单抗的动物最开始是小鼠，后来又有像epitomics这样的公司用兔子的，还有一些人用大鼠神马的，当然其它的动物的也有，据不完全统计，现在能用传统方法制备单抗的动物已经有二三十种了。 但是最主流的还是小鼠和兔子了。兔子不讨论，epitomics对其有特殊的专利，这个基本上和咱们没关系。小鼠，用得最多的还是Balb/C了，因为大多数骨髓瘤细胞（SP2/0, X63, Ag8.653,FO和NSO）都来自于Balb/C小鼠，为了使hybridomas稳定，所以实验小鼠基本上还是Balb/C。 不过有文献提到了用NZB/W小鼠制备高同源性单抗的，原因是NZB/W小鼠是一种容易发生自身免疫疾病的小鼠模型，一般在5个月以下时基本不会发病，但是对自身的蛋白仍然有潜在的排斥反应。

    免疫佐剂： 这一个方向在近十几年以来倒是发展得很快。 最开始的时候Sigma的弗氏完全佐剂和不完全佐剂一直是黄金组合（铝盐佐剂也用得比较多），但是后来人们发现CFA/IFA毛病很多，诸如不利于动物健康、刺激免疫应答周期过长等等，于是各种新式佐剂层出不穷，几乎每家试剂公司都有自己独特的佐剂。而且有效成份也多种多样，如脂质体，CpG，细胞因子，分子伴侣，特殊化学药物（如左旋咪唑）， 细菌或病毒的全部组份或部份（如LPS，肽聚糖），甚至还有一些是中草药提取物（如蜂胶、皂甙，当归多糖）…… 在形式上，大部份还是延用了CFA/IFA的油乳性质，但是这两年来免乳化佐剂在国内发展比较快，如我们现在使用的Quickantibody就是，武汉这边还有另一个产品叫赛弗诺的也与其类似，同时这些新型的佐剂对抗原的使用量要求很低，而且免疫周期也短，所以比较受欢迎，毛病是商家对机理保密，用户无法获知其可能潜在缺点。 总之最后就变成了一种根据个人喜好而选择的产品。 当然另外还有人说佐剂不是必须的，不加佐剂也可以免疫得不错，站长自己没尝试过。

    免疫部位：这个没什么好说的了，也基本上是根据喜好来的，皮下、腹腔、脾内、肌肉、腋下、脚垫、静脉，各种地方免疫都说得过去，而且大家都能成功，所以这个就没什么好选择的了，不过大部份人还是认为皮下是最有效的，因为皮下含有大量的DC细胞，而DC细胞是重要的APC。 这里需要提出的是有一种叫作RIMMS的免疫方式极少人用到，但是据说效果不错。 RIMMS即多位点重复免疫（repetitive immunizations multiple sites），意思是在相同的地方低剂量短间隔重复免疫，一般是在小鼠背上皮下选择四五个点，每三天左右在这些点进行低剂量免疫，一般十几天就可以完成免疫。 大家可以看这篇文献：Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS和这篇：Shorter development of immunoassay for drugs application of the novel RIMMS technique enables rapid production of monoclonal antibodies to ranitidine， 不过成功的实例中，很多人都是取小鼠的淋巴结而非脾脏进行融合的，淋巴结不好取啊。

    免疫周期和间隔： 大部份人基本都同意免疫周期和免疫间隔尽量长一点比较好，这样得到的抗体亲和力更高（除了上述的RIMMS外）。 甚至有人打完第一针后，再过九个月才打第二针的，作者说效果很好，这个方法显然不适合大规模免疫，不然动物管理的压力咱们是承受不起的。另外，一些新型的佐剂则强调短周期也可以得到高亲和力的抗体的， 市场上有很多佐剂宣称两周内即可完成免疫并得到高效价的血清的，实在是太快了。另外最近有文献还对白天免疫动物还是晚上免疫动物更好这一问题作出了探讨，比如这篇：The Circadian Clock Controls Toll-like Receptor 9-Mediated Innate and Adaptive Immunity ， 作者认为一些调控免疫的分子也有生物节律性，它们的表达水生是跟随生物钟有规律变化的，在这些调节分子表达水平比较高的时候进行免疫或许可以得到更好的免疫效果。

    另外还有体外免疫的，即把脾脏从正常小鼠体内取出无菌培养，直接向培养基中添加抗原。 这种方法成功例子也非常多，毛病在于很难得到高亲和力的抗体，几乎所有的抗体都是IgM亚型的，不过也有少数人踩狗屎运得到其它亚型的情况。这种免疫方式可能更多地用于很难免疫成功的抗原，特别是小鼠自身抗原的单抗的制备，比如说要制备抗小鼠白蛋白的单抗神马的，可以看看这篇文章：In vitro immunization effect of growth and differentiation factors on antigen-specific b cell activation and production of monoclonal antibodies to autologous antigens and weak immunogen。只当是一种备用方案了。

    这一部份说得有点分散，就这样结束吧。

    细胞融合

    骨髓瘤细胞： 现在用的大多骨髓瘤细胞还是HGPRT-的， Epitomics公司用的兔子骨髓瘤细胞也是HGPRT-的， 也有极少人在科研中用TK-的骨髓瘤，在其它物种身上得到的骨髓瘤细胞也大多是HGPRT-的（因为HGPRT基因位于X染色体上，容易获得突变株）。目前sp2/0细胞株是用得最多的小鼠骨髓瘤，但是用FO、NS0或NS1的也不少， 其中NS0和NS1出现比SP2/0略早，估计现在使用它们的人估计都是老革命了，而且它们还有一个毛病就是它们可以合成抗体的kappa链，不过不分泌出来； FO细胞则是SP2/0细胞亚克隆筛选得到的，染色体和SP2/0一样也是72条， 它的特点在于其生长速度非常非常快，在含优质血清的培养基中，SP2/0的倍增时间大约为15小时以上，但是FO的倍增时间经常只有七八个小时，所以养起来就容易多了。

    融合的介导： 这个30年来基本没什么改进，化学法主流PEG，另外少数人用电融合，其中PEG介导融合操作方便，成本低，稍作优化基本可以满足绝大多数人的需求，其它的方法如病毒法、激光法等基本上只在基础研究实验室里用，真正做单抗的用得不多。值得一提的是一种基于微流控芯片的细胞融合技术，本来微流控芯片在最近十年左右的时间里研究得相当火热，但是能应用到细胞融合上还是相当有创意的，为了表示敬仰，我把这个稍稍说详细点： 一般的细胞融合中，目的融合子是AB型的，但是通常会得到大量的AA，BB这样的融合子，而且融合时AA和BB细胞自身靠得更近，所以真正能形成AB融合子的细胞是非常少的，Voldman等在Microfluidic Control of Cell Pairing and Fusion一文中介绍了一种微流控芯片，将A细胞通过此芯片，A细胞则被捕获在芯片上的小杯中（此小杯只能容一个细胞），再用反向的液流逆向冲刷细胞，则A细胞从原来的小杯掉到背向的大杯里（大杯可以容两个细胞），经过这一步后，大杯里基本上满足一杯一个A细胞，然后再将B细胞流过大杯而被大杯捕获，那么最终的结果就是一个大杯里有一个A细胞和一个B细胞，最后再融合它们，据说这个方法可以使50%左右的脾脏细胞参与融合，而我们现有的融合方法只有不到0.1%的脾脏细胞参与融合，可以想象此方法效率多高！ 不过需要指出的是，如果我们用这个办法做融合，我们将得到很多很多克隆，以至于完全没有精力做筛选。

    在制备传统单抗的同时，还有人想制备出双特异性单抗，即制备出来的单抗可以同时识别两个表位，其方法是用我们普通的方法制备出识别一个表位的杂交瘤，然后将此杂交瘤再一次诱变成HGPRT-的细胞，将此细胞作为瘤细胞再与免疫了第二种表位抗原的小鼠脾脏细胞融合，最后得到的单抗即可以识别含第一种表位的抗原，也能识别含第二种表位的抗原。在我看来这个事情被他们搞复杂了，直接制备出两种单抗然后再按比例混合肯定比这个来得容易。

    写到这里，我想和大家一起回忆一下单抗的定义：只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个Ｂ淋巴细胞的克隆或一个杂交瘤细胞的克隆。这个定义下得非常好，同时有个细节需要注意，单抗不只是来自杂交瘤细胞，还可以直接来自B淋巴细胞！我们进行细胞融合的主要目的就是为了使B细胞可以无限传代，所以如果有办法让B淋巴细胞（准确地说应该是浆细胞）直接具有无限传代的能力那是不是不用细胞融合这一步了呢？ 答案是肯定的！Renata Pasqualini和 Wadih Arap早在2003年就发表了一篇文章：Hybridoma-free generation of monoclonal antibodies，就讲到了完全不需要杂交瘤而制备单抗的办法：将抗原注射到H-2Kb-tsA58转基因小鼠体内，免疫结束后，直接将脾脏细胞磨成单个细胞，于33度培养即可。 原理: 该实验中小鼠转了SV40大T抗原和由干扰素诱导的主要组织相容性复合物H-2Kb(作为启动子)，这种小鼠的细胞在Gamma干扰素诱导下，于33度的许可温度时就表达TsA58基因，这是一种来自猿的肿瘤基因，表达这个基因的细胞具有无限增殖的能力（，这样就达到了无限传代的目的了。这种方法制备单抗看起来比较方便，但不知道为什么用的人不多，也许是克隆形成效率有限吧。

    克隆筛选

    克隆筛选无疑是整个单抗制备过程中相当关键的一步，在单抗制备史上，单克隆筛选一共可以分为三个时代：第一代筛选基本上都是基于红细胞花环形成实验为代表的凝集反应的方法，第二代就是主流的间接ELISA，第三代则是ELISA（或缺）结合特定实验目的的综合筛选方法。第一代检测方法都用红细胞花环形成实验来检测是因为K?lhler和Milstein他们当时制备的人类历史上第一个抗体是针对绵羊红细胞的，为什么要制抗绵羊红细胞的单抗这个就不得而知了，只是恰好他们可以得到抗绵羊红细胞细胞膜上的分子的抗体，所以正好可以用红细胞花环形成实验来筛选了（在当时红细胞花环形成实验还是比较简单的）。所以在接下来很长一段时间内，有很多人模仿这个实验，努力改进筛选的时候也尽量往这个上面靠，比如说抗原不是红细胞表面上的，想办法也要找个红细胞连上去。接着就到了第二代，也就是ELISA的普及，因为ELISA的通量可以非常高，所以很受欢迎，当然这个ELISA不见得仅仅是我们现在常用的间接ELISA。

    后来人们慢慢地发现，虽然ELISA阳性的克隆可以很多，但是真满足实际需要的克隆非常之少，拿常见的WB来说，一般六七株里通常只有一两株可以做WB，而IHC则更悲剧，一二十株细胞里才有一两株能满足实际应用的或者数十株里也没有一株合适的，所以大家觉得在筛选的时候最好有两种或者更多的鉴定方法，而且其中有一种是与实验目的相同的筛选方法。有人肯定会说，那么多细胞株，有些方法很难达在通量上满足要求啊，面临这个问题的不只是你我，世界上几乎所有做单抗的人都面临这个问题，想想早期的K?lhler和Milstein，他们那么多细胞株用红细胞花环实验也都一一筛选了一次呢。现在我们至少有操作方便很多的ELISA作为初步筛选。当然也有不少人非常执着，比如有个叫Elizabeth Moran的，他做IHC应用的单抗就直接用IHC筛选细胞株，好几篇文章都是用这个方法，对此他比较淡定，对详细的过程也没有作太深入的描述。值得注意的是，这位仁兄对抗原确比较有讲究，他非常喜欢用制备好的组织切片作为起始材料，然后按照IHC的常规步骤脱蜡、除二甲苯、过渡到PBS，然后简单做个总蛋白定量就拿去免疫动物，还是那句话：做什么样的实验，就用什么样的抗原，能用天然尽量就天然的。

    扯远了，还是扯回到筛选上来，上面提到了ELISA结合实际应用的实验，也就是WB、IHC、IF、IP、ICC、FCM（这个对于细胞表面的分子特别有效）之类的，还可以是比较少见的细胞ELISA（和ICC有点像）放免、体外中和实验等，具体操作就不细说了。这里说说一些比较特殊一点的方法。 第一个方法是印迹显色法，文献报道的不多，是一种建立在半固体培养基础上的筛选方法，即把杂交瘤从一开始起就养在半固体培养基上（表面），数日后将灭过菌的NC膜铺在培养基上，并做好相对位置的标记，NC膜可以直接与细胞接触，于是细胞所产的抗体也被NC膜吸收，经过一段时间后取出NC膜，封闭，再将膜泡在经过标记的抗原上（也可以使用标记过的anti-Tag+抗原），最后显色即可，显色后确定阳性克隆，再根据位置标记就知道培养基上的阳性克隆位置。整过过程有点像直接ELISA，不过操作起来并没有多少优势。 第二种方法是一种可以被称为“原位荧光筛选”，也是基于半固体培养基的，其方法是将抗原标记上荧光，然后加到半固体培养其中，将融合后的细胞养在此培养基中培养，随着杂交瘤的生长，阳性克隆逐渐分泌抗体，于是半固体培养基中标记过的抗原逐渐聚集在阳性克隆周围，当激发光激发抗原上的标记物时，阳性克隆就表现为周围都呈现荧光，将这些阳性的细胞挑出即可进行后续步骤。挑克隆的过程即可以手工完成，也可以借助机器完成。德国的AVISO GmbH公司的CellCelector就是这么一款机器，它的原理是完全模拟手工进行挑克隆。而Life Technologies（原Invitrogen和Applied biosystem合并后的公司）的ClonePix FL则更胜一筹，只需要将原板和新鲜的液体培养基板一次全都放到仪器里，设定一下筛选方案，它就可以全自动完成，并且每挑一个克隆后，它还会自己对tip头进行灭菌和烘干，这应该是至今最Smart的筛选机器了，其价格也不菲，至少在100万人民币以上。不过，这种原位荧光筛选方法有一个明显的缺点，就是需要将抗原做上荧光标记，这件事情是一件比较麻烦的事情，而且成本也不低，过程不好控制。也有人直接用荧光二抗的，先大致分出能分泌抗体的克隆，再用其它的方法判断它们能否识别抗原，但是这样就使过程变麻烦了，还不如一开始就用直接ELISA。

    最后再总结一下适用于高通量单抗制备的一些筛选方法。首先是蛋白质芯片筛选，直接将作为抗原的蛋白质喷点在膜上、玻璃基质上或者酶标板内，再进行间接ELISA的方法，这种方法用的人应该比较多，而且对于芯片结果分析的仪器也非常成熟了。另一种方法是借助于刚才说到的原位荧光筛选，即同时将多种抗原分别标上不同的荧光，同时加到培养基里，待杂交瘤生长好以后，可以凭细胞周围的荧光的颜色就知道它产的抗体识别的是哪种抗原了，不过因为荧光的种类有限，所以通量不会很高，而且结果可能会不好判断，同时还面临着标记多种蛋白的难题。第三种方法，是基于分子之间相互作用的一种筛选方法，使用GE公司的Biocore 100之类的仪器，它的筛选原理是判断通过其样品槽的液体与固定好配体之间的动力学数据而确定阴性和阳性的，个人觉得这个机器原理比较复杂，还没完全弄清，其宣传的优点是不需要标记抗原即可完成筛选，我看原理看得比较迷茫，有兴趣的自己去看吧。最后一种高通量筛选就是站长自己在用的方法，就不细说了。

    总之，筛选过程是整个单抗制备中犹为重要的一步，一个优秀的筛选过程对于单抗制备来说非常重要，筛选过程不仅要可靠，还要快速，因为细胞不能在同一孔养太久，所以一般一天内完成筛选最好，同时筛选的手段要尽量接近实际应用实验。

    单抗的大规模制备、纯化与鉴定

    这个话题涉及的问题需要超出本话题的讨论范围了，先尽量不偏题吧。

    在筛选到阳性的细胞株后，在进行扩大规模生产之前一定要反复确认此细胞株产生的抗体是否真正地能够达到应用标准，如果认为细胞上清中的抗体不纯容易对结果造成干扰，则可以进行一个稍大一点规模的培养或制备腹水进行纯化，然后再进行检测，这一部份就不多说了，直接参考Proteintech Group的BBS上Dr. Lan的帖子http://www.ptgcn.com/bbs/viewthread.php?tid=2451&extra=page%3D1??待确认细胞株无误并且保种充份后即可根据需要考虑进行大规模生产了。

    大规模生产单抗的方法分为体内法和体外法，体内法最常见的就是制备腹水了，这个是很早以前就有的技术，现在市场上的大部份单抗都是通过这种方法生产的，就不多说了，这种方法产生腹水，有效抗体浓度基本在0.5-5mg/ml之间，大部份都集中在1-2mg/ml左右，一只小鼠可产4-10ml腹水。另一种体内法是将细胞注射到大型动物子宫内的方法。这个方法现在没听说有人用，只是有文献提到在上个世界80年代时，美国国际单克隆制备公司（这是个神马公司？？？）和Kansas State University的科学家建立的方法，即把细胞接种到大型动物（牛或羊）的子宫内，然后其子宫内产生含抗体的液体，和腹水的过程基本相仿，最后可以从动物子宫内一次性获得几升的液体，其中抗体浓度在5-20mg/ml，相当高了！不知道为什么后来这个方法就没人使用了，估计操作麻烦同时涉及动物福利问题。

    另一种扩大规模生产的方法是在体外进行，最初的体外培养基本和养菌差不多，用到的技术也和细菌的培养大同小异，比如说有摇瓶培养，有发酵罐培养，有中空纤维柱培养……这些技术都比较成熟了，最终的选择其实仅仅和规模的需要有关了，一般认为，如果抗体的需要量在10mg以下，基本的方法就是直接用多个flask进行独立培养，也可以使用转瓶培养；如果抗体的需要量在10-100mg之间，则用转瓶培养比较合理；需要量在100mg-1g之间，可选用渗析管（例如greiner bio-one公司的MiniPerm）进行，另外武汉瀚湖细胞有限公司也有一种比较有特色的产品，其结构类似于转瓶，但是据说可以把细胞养到极大浓度的状态，甚至可以形成类似组织块的结构，所以理论产量肯定远远大于转瓶；在1g至10g范围内，可以用中空纤维柱进行；在10g-10Kg的范围内，可以考虑用不同规格的发酵罐培养。 目前尚未听说有更大的数量级需求的抗体。如果既想大规模生产抗体，又不想让发酵体积变得非常大，此时可以借助微囊或微珠了，其原理是将细胞与凝胶原液混合，再使凝胶固化，最后加入囊化剂使其形成囊状结构，细胞就在此囊状结构中生产，整个过程类似于近海区的水产品人工养殖过程，微囊里的液体与整个液体培养环境相通，但细胞被其包裹，在此微囊中，细胞往往可以形成极高的浓度。

   不管用哪一种方法进行大规模培养杂交瘤细胞，最终得到的抗体总是和其它的杂蛋白混合在一起，因此纯化这一步总是必需的。在纯化之前，先提一下抗体亚型鉴定的问题。一般认为，杂交瘤产生的抗体可能为IgG，IgM，IgA中的一类，另外IgG又有同种亚型：IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，以一些特殊品系的小鼠作为host动物作融合的，还可能有IgG2c这一亚型，关于亚型鉴定的意义以及各种亚型之间的差异，我将另外单独讨论，此贴仅讨论新技术新方法。由于单抗的亚型在很大程度上决定了其纯化所采用的方法，所以相对于传统的多抗检测来说，亚型鉴定是单抗特有的一个属性。现在检测单抗亚型基本上有三种方法，一是使用分型二抗自行检测，二是使用Isotyping ELISA kit，根据kit的操作说明进行简单的ELISA操作，第三是用试纸条进行检测。对于有大量的样品需要检测，用第一种方法显然最经济，用三种方法速度最快，但也最贵，第二种方法在操作上和成本上都介于二者之间。

    最后就是纯化过程。单抗的纯化手段较多，几乎所有的蛋白质技术中用到的纯化手段都可能被用来进行单抗纯化。在纯化之前，通常需要对腹水或者细胞培养上清进行初步除杂。对于细胞碎片和油脂，离心和SiO2吸附法较为常用，如果是非常大的体积的细胞培养上清，则可能使用板框等源自微生物发酵工艺中用到的设备进行过滤。对于高丰度杂蛋白（如鼠自身白蛋白，培养基中的白蛋白等）可以通过沉淀法去除，如果体积较小，则可以使用专门的亲和柱除去，据推测，那些商品化的除高丰度蛋白的亲和柱无非就是偶联了相关的抗体的填料。另一件预处理中需要做的事情就是浓缩低浓度的抗体溶液，对于小体积样品，通常推荐超滤浓缩，超滤浓缩是保护抗体活性的最好浓缩方法，对于体积比较大的样品，多采用真空离心浓缩，也有采用氮吹仪和冷冻机的。 当样品体积达到了可以接受的水平，即可进行纯化，常用的纯化方法有盐沉淀法（主要是辛酸-硫酸铵法），离子交换法，亲水疏水层析，凝胶过滤法（尤其是纯化IgM亚型抗体的时候常用，可以正向用，也可以反向用），再就是各种亲和纯化了，目前商业化的亲和纯化填料有Protein A, G, L，还有一个暂时不记得了，ProA, G就不说了，大家都熟悉，Protein L则是最近几年才流行起来的，主要识别抗体的kappa chain，而小鼠单抗有95%的机率为kappa型，所以可以用它纯化，但是其成本相对Protein A,G贵许多，只是作为一种备用材料而已，但其在纯化IgM亚型的抗体时优势较明显。 用Protein A, G ,L 这类填料可以很容易实现10g级抗体的纯化，而且纯化的产品纯度相当高，但因填料较贵，所以一般只作为最后一步使用。除此之外，小规模纯化也采用抗原直接做亲和纯化的，一般难以实验大规模操作，具体过程大家也都熟悉了，不再细说了。

    需要指出的是，小规模纯化抗体基本不用过于考虑成本问题以及操作的复杂性的问题，但是当采用体外法大规模生产时，通常用多种纯化方法相结合，以达到最理想的纯化效果（高回收率，高纯度，低活性损失），同时又可控制成本。在放大体系之前，都需要做小试进行严格的论证才可以达到事半功倍的效果。

    纯化完抗体之后，就是质检的事了，又回到了Dr. Lan讨论的话题，这进而就不再深入讨论了，http://www.ptgcn.com/bbs/viewthread.php?tid=2451&extra=page%3D1
到这里，传统单抗制备方法的一些新的进展差不多就这些了，由于本人水平有限，参考的文献也有限，所以有不周到之处，请大家多多指正。 另外，说到进展，其实整个单抗的最大的进展也是最有经济前景的进展当数人源化单抗了，已不属于此话题讨论范围，日后再另外讨论。
P.S. 关于抗体亚型的一些讨论，也将和大家另外讨论。

zylee

重组抗原做出好的单抗的不多