甲基化检测方案大汇总（二代与验证）

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高通量甲基化检测方法：（公司不同，要求也有些差异）

方法	流程	优点	缺点	样品要求
全基因	DNA随机打断与末端修复-连接甲基化接头-重亚硫酸盐修饰-PCR扩增-Xten测序仪测序-数据分析	单碱基甲基化，数据量大，基本覆盖所有位点。物种不限	由于数据量大，无用数据占大部分，价格很高，深度相对低。	类型：完整的总DNA 起始量：≥ 50μg 浓度：≥50 ng/μL 纯度：OD.260/280：1.8~2.0
RRBS	基因组酶切-DNA片段末端修复-连接甲基化接头-重亚硫酸盐修饰-连接产物纯化-PCR扩增-Xten测序仪测序-数据分析	在其覆盖范围内可达到单碱基分辨率 测序区域更有针对性，数据利用率更高 价格适中	主要受酶切特异性限制，部分重要位点不识别，仅针对少数有对应的特异酶的物种（人和小鼠）	类型：完整的总DNA 起始量：≥ 5 μg 浓度≥50 ng/μL 纯度：OD.260/280：1.8~2.0
Medip	基因组DNA重亚硫酸盐修饰-打断建库-Xten测序仪测序-数据分析	相对全基因甲基化降低了成本 价格适中	只能得到片段甲基化程度，仅针对模式动物，如人和小鼠	类型：完整的总DNA 起始量：≥ 40μg 浓度≥500 ng/μL 纯度：OD.260/280：1.8~2.0
定制捕获测序	DNA重亚硫酸盐修饰-液相芯片捕获-打断建库-Xten测序仪测序-数据分析	单碱基甲基化水平，测序深度高，区域精确，物种不限 价格低	需要定制芯片，样本太少定制芯片不划算	类型：完整的总DNA 起始量≥ 5 μg 浓度≥50 ng/μL 纯度：OD.260/280：1.8~2.0
850K芯片（人）	DNA重亚硫酸盐修饰-全基因组扩增和酶切片段化-芯片杂交-掺入荧光标记的核苷酸进行单碱基延伸-扫描获取杂交图谱-数据分析	技术重复性好 样本不受限 成品芯片 FFPE样本 价格较低 ·	跟其他方法相比，数据量较小，主要针对启动子区域。	类型：完整的总DNA 起始量≥ 5 μg 浓度≥100 ng/μL 纯度：OD.260/280：1.8~2.0

甲基化验证方法：（公司不同，要求也有些差异）

方法	流程	优点	缺点	样品要求
MSP	重亚硫酸盐修饰-pcr扩增-电泳-OD值测定	价格低   简单	只能检测单个CG，不精确	类型：完整总DNA 浓度≥20 ng/μL 纯度OD.260/280：1.8~2.0
qMSP	重亚硫酸盐修饰-Realtime PCR扩增	价格较低，直观	准确度不高
bsp	重亚硫酸盐修饰-pcr扩增-构建载体-挑10个克隆子测序-计算概率（克隆子越多越精确）	个数不限，实验室条件不高，能构建载体的基本足够了，送测序公司测序	精确度要根据克隆子个数。
质谱	重亚硫酸盐修饰-PCR扩增-体外转录-酶切-质谱(MALDI-TOF MS)	片段较长 5-600bp/反应 12个起 价格适中	转录易降解 连续两个CG，取平均值，导至结果不精确
焦磷酸测序	重亚硫酸盐修饰-PCR扩增-焦磷酸测序仪	准确度高，金标准 价格较贵	50bp/反应，超过50bp则需分段检测	类型：完整总DNA 浓度≥40 ng/μL 纯度：260/280：1.8~2.0

简单介绍：

    1、芯片（不知道目的基因的话，可以查文献，也可以用芯片筛选）。一般至少3个对照组，3个病例组。目前450k芯片已停产，新版本850k芯片覆盖超过850,000个甲基化位点，可对包括FFPE样本（首款）在内的多种类型样本进行甲基化检测。

全基因组覆盖（>850,000个甲基化位点）

• CpG岛
• 非CpG
• FANTOM5增强子
• ENCODE开放染色质及转录因子结合位点
• miRNA启动子区
  
  

良好的技术重复性

• 98%技术重复性
• 与450K结果的一致性极佳（r> 0.98）
• 涵盖90% 450K芯片上的CpG位点
  
  

              2、bsp，用pcr扩增，构建载体（挑10个克隆子测序，计算概率，当然克隆子挑的越多越精确）片段大小一般300-400bp/反应。（普通引物即可）

         个数不限，实验室条件不高，能构建载体的基本足够了，送测序公司测序即可。

  首先DNA用亚硫酸氢盐处理，所有未发生甲基化的C被转化为U，而甲基化的C不变；随后再CpG岛两端设计引物进行PCR，纯化后进行TA克隆，每个克隆挑取阳性克隆测序，最后将测得的序列与原始序列比对，统计甲基化位点及数量，并分析甲基化程度。

              3、质谱甲基化：500-600bp一个反应，12个样品起才能上机。(主要针对片段较长，样品量较多的情况比较划算，但是有个缺点，连续两个CG，是取的平均值）

首先，使用甲基化修饰试剂盒对DNA样本进行处理，是未被甲基保护的C变成U。然后，使用特殊设计的引物（末端带有T7RNA聚合酶启动子序列）对修饰过的DNA样本进行普通PCR扩增。再将扩增产物放置到体外转录体系中，利用T7RNA聚合酶进行体外转录，获得对应的RNA产物。接着，在体系中添加RNaseA，利用其特性将RNA产物酶切成小片段，每个小片段包含1个或几个CpG位点。然后用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS) 检测反应产物，以确定样本每个CpG的相对甲基化程度。

甲基化检测的质谱分析方法的原理是基于MALDI-TOF MS可以根据分子量的大小将不同的产物分离并根据质谱峰图进行相对定量。在甲基化检测中，由于同一个CpG位点存在甲基化保护和未保护两种状态，通过一系列反应，可以得到除该CpG位点外，其余部分完全一样的两种产物。这样，两种产物的分子量差别，就完全取决于该CpG位点的分子量差异。这样，就可利用MALDI-TOF MS的特性，分离两种产物，并根据质谱峰的大小进行相对定量。

              4、焦磷酸测序（金标准），50bp/反应，超过50bp则需要分段检测。（仪器贵，所以价格贵，但是准确度高，适合位点集中的小片段，量多的情况，因为修饰引物也是得收费的，均摊到每个反应，是样品越多越好）

    是由4种酶催化的酶级联化学发光反应。其原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase).荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。

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来源：琳琳猫基因

Nothing

好好学习一下

月下

刚好在做甲基化的，学习学习