国外植入前遗传学诊断指南解读

检验之星

1990年世界首例植入前遗传学诊断（PGD）试管婴儿的出生标志着人类辅助生殖技术的突破性进展。近十年来，随着单细胞全基因组扩增技术及分子遗传学诊断技术的发展，植入前遗传学诊断技术得到迅速发展及广泛应用。2008年PGD国际协会（PGDIS）公布的数据显示，可进行植入前遗传学诊断的单基因疾病种类约170种。目前国内尚缺乏植入前遗传学诊断技术规范，为此，本文以“consensus”or “guideline”, and “PGD” or “PGS”为关键词检索了2010年至今的关于国外植入前遗传学诊断技术规范或指南相关文献，并就此解读。

1 国际PGD指南概况

成立于2002年10月的PGDIS 2004年颁布了PGD技术指南（PGDIS, 2004）。并于2008年修正了PGD操作流程及实验室质量保障指南，就PGD实验室建立、标本取材、诊断技术、胚胎移植、质量控制与保障、遗传咨询与随访等提出了建议。欧洲人类生殖与胚胎协会（ESHRE）PGD联盟就PGD实验室的设立及相关的3项技术：DNA扩增技术、荧光原位杂交（FISH）技术、胚胎活检建立了相关指南。2015年，Tur-Kaspa等提出了用于HLA配型的PGD指南，有助于指导PGD技术在选择与罹患血液系统疾病、急需脐带血干细胞（骨髓）移植患儿的父母选择HLA配型符合的胎儿中的规范应用。作为高加索人群中最常见的单基因遗传病，囊性纤维瘤在欧洲人群中的患病率为1/4000，Girardet等2015年则提出了囊性纤维瘤PGD指南，可作为单基因病PGD技术指南参考。这些指南有助于规范PGD技术，并建立符合中国国情的PGD技术规范和指南。

2 PGD实验室建立指南

PGDIS建议应根据ESHRE Embryology Specail Interest Group 的推荐建立合理的IVF实验室及高效的PGD实验室。PGD流程中包括胚胎培养、胚胎活检、细胞固定、细胞DNA扩增、荧光原位杂交、基因测序、胚胎移植等诸多环节，各实验室应建立充分的信息交流，并遵循严格、一致的质量控制标准。所有实验室操作流程应记录在一本操作手册上，实验室负责人应及时更新操作手册，并确保每一位相关工作人员掌握最新的操作流程。这样才能保证治疗结果的一致性。PGD过程中，胚胎活检、胚胎的独立培养、根据PGD结果选择可移植胚胎是最重要的3个环节，须双人审核。PGD实验室应能够同时开展包括FISH和聚合酶链反应（PCR）的单细胞遗传学分析与诊断技术。

因为极体活检、卵裂期胚胎活检和囊胚活检都可用于PGD，所以PGD中心必须有经过正规培训的胚胎学工作人员熟练掌握并长期操作上述技术，即使上述活检技术不是在每一个PGD中心都常规开展。PGD实验室建立过程中应格外注意避免外源性细胞或DNA污染活检细胞，外源性DNA污染包括来源于操作者导至的污染等。严格遵循PCR实验室操作规范。基因扩增前的操作应在独立的区域且在超净工作台下进行，PGD分析应能检测出母源性及父源性DNA污染的可能性，否则存在较高的误诊风险。活检后的细胞应在相邻的独立区域进行细胞固定（用于FISH）或全基因组扩增（用于PCR）。标本的标记和识别是一个高风险环节，在细胞固定或转入PCR反应管时、胚胎诊断及诊断后对应胚胎这3个环节上必须经过双人审核与认证。国内外都有很多生殖中心将活检后的标本外送至特定的检测公司或实验室进行诊断，此时必须在生殖中心与检测实验室之间建立严格的标本运输与接收、标记体系，同时应明确双方权责。生殖中心和检测实验室之间应就法律、保险和责任签署正式合同。建议生殖中心和检测实验室共同使用联合知情同意书。生殖中心进行的细胞固定或转入PCR反应管的操作需要得到检测实验室的结果认可后方可施行临床标本检测。

3 胚胎活检技术指南

可用于PGD的细胞来源包括卵子极体、卵裂期细胞、囊胚滋养外胚层细胞。不同来源的细胞可进行不同目的的PGD，极体活检主要用于检测卵子非整倍体及母源性遗传病，不能检测父源性遗传性疾病，目前国内几乎没有生殖中心采用极体活检。卵裂期及囊胚细胞可用于几乎所有的PGD。

胚胎活检可通过机械法、化学法、激光法在透明带开孔。PGDIS建议只能在透明带上开一个孔，以避免细胞丢失或胚胎孵出时嵌顿于透明带开孔处。应避免开孔过大（>60μm）、过度挤压胚胎、激光能量过高，上述操作均可能损伤胚胎。

活检培养基使用与胚胎培养相同的培养基，除了Ca2+、Mg2+外，其他物质含量相同，以避免胚胎休克。活检培养基中加入蔗糖有助于细胞皱缩，从而缩小细胞体积，便于从透明带开孔出取出细胞。活检速度非常重要，建议进行胚胎活检时由另一名胚胎学工作人员协助准备及更换培养皿，以缩短胚胎暴露于培养箱外的时间。理想的活检时间是每个胚胎不超过1 min。PGDIS强调生殖中心应配备足够的培养箱，以缩短胚胎活检过程中胚胎暴露于培养箱外的时间，减少开关培养箱次数，避免由此引起的温度波动。

胚胎活检中操作者的经验对PGD结果及IVF妊娠结局都具有十分重要的影响。PGDIS推荐胚胎活检操作者必须具备丰富的经验并常规操作该技术。PGDIS推荐利用废弃胚胎练习操作，不断提高操作技能，并强调，不建议偶尔操作的人或经验不足的人进行胚胎活检。生殖中心有义务验证活检过程不会影响胚胎发育潜能。

针对卵裂球活检，PGDIS推荐活检的胚胎至少为5个细胞期以上，只能取1个细胞，避免取2个细胞。活检的细胞应完整，并有清晰可见的细胞核。较多文献支持D3胚胎活检可能影响胚胎发育潜能。目前国内外越来越多的PGD中心采用囊胚活检取代卵裂期胚胎活检。

4 胚胎诊断技术指南

染色体异常的PGD可通过FISH及全基因组扩增后的芯片或测序技术诊断。

4.1　针对FISH的PGD技术指南 使用甲酰胺、冰乙酸可减少细胞固定后的信号重叠及相应的误诊风险，减少细胞核丢失和DNA碎片化。固定过程中细胞浆破裂后不应继续加固定液。杂交前须在相差显微镜下确认并标记细胞核，并检查胞浆是否去除干净，否则会影响杂交效果。细胞固定是一个技巧性强的操作，可利用D2鼠胚练习细胞固定操作。PGDIS推荐PGD前先通过正常或三体细胞株验证FISH探针。FISH的杂交率应在95%以上。用于检测非整倍体的FISH探针至少应包括X、Y、13、15、16、18、21、22号染色体探针，因为这些是自然流产胚胎中最常见的三体异常。FISH用于染色体平衡易位患者的PGD时，使用的探针应至少包括2个端粒探针和一个着丝粒探针，或2个着丝粒探针和一个端粒探针，这样能检测出所有的非平衡染色体组合，同时PGDIS推荐PGD前首先用携带者的淋巴细胞验证探针效果后再进行临床检测。

4.2　针对PCR的PGD技术指南 ESHRE PGD联盟推荐基因扩增前区域必须是独立于IVF实验室的区域，在层流或层流净化罩下进行扩增前DNA标本处理。严格遵循PCR实验室规范标准，必须施行单向工作流程。因PGD中检测DNA为微量DNA，所以在确保独立分区内进行扩增前的标本处理，一般不存在气溶胶污染风险。但应注意避免操作者导至的外源性DNA污染，所以扩增前处理标本时应注意操作者须穿隔离衣、戴口罩、帽子，以避免污染检测标本。所有的耗材，包括吸头、试剂都应无DNA及DNA酶。为避免精子来源的污染，针对PCR的PGD必须使用卵泡浆内单精子显微注射（ICSI）方式授精，同理，应尽可能去除颗粒细胞，以减少母源性污染。胚胎活检过程中，如果取材过程中细胞破裂，建议更换活检针。活检后的细胞在转入PCR反应管前应冲洗2遍，以尽可能少的培养基转入PCR反应管。细胞完全裂解及充分变性是PCR的关键，碱性溶细胞液和蛋白酶K/十二烷基硫酸钠都可得到理想的效果。

PGDIS推荐首先利用口腔黏膜细胞、淋巴细胞或丢弃、捐赠的囊胚验证单细胞扩增有效性，达到以下质量标准后再进行临床检测：扩增率不低于85%；PCR扩增时应同时扩增目标基因及目标基因邻近的高度多态性标记物，这样可检测到扩增失败和ADO；利用多态性标记物可检测和避免外源性DNA污染，并确保外源性DNA含量不超过5%方可进行临床检验。推荐使用巢式或半巢式PCR，或多重荧光PCR。

PCR用于PGD临床检测时必须设立阴性和阳性对照，阴性对照应包括最后一个胚胎活检后的培养基。为了降低等位基因脱扣（ADO, allele drop-out）风险，ESHRE推荐DNA扩增引物设计中应包括致病基因，以及致病基因位点之外的、相邻的相关及不相关位点，通过高度多态性标记物的分析，可以判断外源性DNA污染及ADO，从而提高单基因病PGD准确率。近年来越来越多的中心使用连锁分析技术用于单基因病的PGD，基因连锁分析必须结合不育夫妇及先证者、甚至不育夫妇双亲的DNA分析。

5 结果判断与出具报告

所有报告应以书面形式出具，联合实验室可通过传真或邮件发送书面报告，细节可通过电话沟通。报告要求格式固定、结果清晰、界面友好。PGD报告应包括以下内容：实验室名称及信息，包括实验室名称、地址、联系电话等；医生信息；报告日期；报告名称（疾病名称+PGD）；检测疾病及基因名称；夫妇姓名及出生日期；标本信息（标本类型、取材日期、收到日期、检测日期）；检测方法；检测结果；误诊率；检验者及审核者签名；页码及总页码数。无论FISH或PCR结果，PGDIS均建议由两名具备诊断资质的人员分别审阅分析，独立出具诊断意见，诊断一致时方可出具诊断报告。如果两名诊断人员判断的结果不一致，应重复检测，必要时重新活检。在不能出具明确诊断报告时，应充分告知病人，并由患者知情选择。建议在与患者讨论PGD结果前，应由生殖中心有资质的专业人员认真审查。

6 遗传咨询与随访

遗传咨询是PGD的一个重要环节和内容。遗传咨询中，生殖中心应全面了解患者的生育状况，并给予充分的遗传咨询，全面了解患者夫妇双方遗传病发病情况，绘制家系图谱，必要时完成与妊娠结局相关的其他检查，包括精液分析、染色体、宫腔镜检查。PGDIS推荐生殖中心应告知患者PGD的过程、采用的方法、技术的局限性及预期结果。知情同意书中应包括机构的PGD误诊率，并告知患者其他选择，包括自然妊娠后产前诊断的选择及面临的后果。其中误诊率数据的来源应为生殖中心上一年临床数据总结，包括临床发生的PGD误诊（由产前诊断或产后新生儿基因、染色体诊断证实），以及以未移植的胚胎再次重复分析的结果判断的误诊率。PGDIS强烈推荐不适宜冷冻及移植的胚胎应用于验证PGD结果，通过再次对所有卵裂球再次检测分析，评估PGD误诊率。系统分析有助于判断PGD的有效性，并评估单细胞的误诊率，PGDIS建议误诊率应低于10%。

PGD后的随访是评估PGD有效性的关键。随访的内容包括着床率、临床妊娠率、临床流产率及新生儿随访，由于流产胚胎中大多数与胎儿染色体异常有关，所以应对流产组织进一步分析，从而评估PGD结果准确性。新生儿随访应了解有无明显或轻微的出生缺陷，以评估胚胎活检可能对子代的影响，必要时应复查新生儿遗传信息。生殖中心和检测中心应就PGD后的随访及数据收集达成一致。

PGD妊娠后是否需要进行产前诊断，目前国内大多数生殖中心持支持观点，PGDIS也建议所有PGD妊娠后患者行产前诊断，但PGDIS建议应向患者提供所有可供选择的产前诊断方式信息，包括绒毛取材、羊水取材、超声诊断及无创产前诊断，如胎儿游离DNA检测。对于拒绝接受产前诊断的患者，应在分娩时抽取脐带血验证染色体、基因结果，为总结PGD效率提供真实有效的数据。

值得注意的是，指南的目的是促进PGD中心提供更好的医疗服务，而不是以保证医疗结果为目的而制定的。指南不能涵盖所有操作或检测，也不能排除可能获得相同结果的其他操作或检测。医生和实验室技术人员应根据自己的专业判断来决定优先选择的操作或检测。要注意指南出版的时间，并关注指南颁布之后的文献和科学研究报道。

来源：中国实用妇科与产科杂志 作者：刘东云，黄国宁 单位：重庆市妇产科医院遗传与生殖研究所