【系列】血液中的宝藏：细胞外RNA

检验之星

血液是唯一与所有器官都有接触的组织，携带着有关机体的大量宝贵信息。在理论上，检测血液携带的 DNA、RNA、囊泡和细胞残骸可以帮助人们诊断和监控各种疾病。产前基因筛查是血液检测的一个重要应用，不过其他循环生物学指标正在受到越来越多地关注，比如甲基化、RNA、微囊泡和外泌体。为了帮助大家更好的分析甲基化、分离囊泡、提取RNA、存储样本和分析数据，The Scientist杂志最近与多位专家学者探讨了检测不同血液生物学指标的策略，贡献出了相应的注意事项和实验技巧。

研究者：加州大学圣地亚哥分校副教授Louise Laurent，美国转化基因组研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen

研究项目：鉴定胎盘功能障碍（Laurent）和大脑损伤（Keuren-Jensen）的循环miRNA指标

研究背景：近年来，人们在血浆或血清样本中成功检测到了疾病相关的RNA（exRNA）。这些细胞外RNA可以成为非侵入性的疾病诊断指标，这是RNA检测最有前景的发展方向之一。在多种细胞受到破坏的疾病中（比如大脑损伤），循环miRNA是非常重要的生物学指标。研究这些miRNA的团队很多，可供选择的实验方案也不少，不过研究者们还没有就此达成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美国NIH细胞外RNA交流协会的成员，他们正在努力推动循环miRNA检测的标准化，提升细胞外RNA研究的可重复性。

胎盘囊泡：在妊娠期间，胎盘会将包含RNA的囊泡释放到母体血液中。Laurent希望从中鉴定胎盘疾病的miRNA指标，比如子痫前期和宫内生长受限。她和同事正在优化自己开发的方法，从外泌体和微囊泡提取miRNA并分析相关数据。初步研究结果显示，母体血液中的外泌体和微囊泡都可以分离出妊娠特异性miRNA。妊娠后期的miRNA指标与胎盘组织的关系尤为密切。

大脑撞击：Van Keuren-Jensen团队将监控撞击数据的感应器装在橄榄球运动员的头盔中，并在橄榄球赛季中收集运动员的血液、尿液和唾液样本。他们对这些样本进行RNA测序，寻找与撞击数据有关的生物学指标。研究人员使用了一系列商业化试剂盒，并且对细胞外RNA收集方法进行了比较。“使用不同的试剂盒或分离方法会造成很大的差异，”Van Keuren-Jensen说。“现在还很难断言哪种试剂盒最好。”

注意事项：有些测序试剂盒使用带“粘性”末端的短片段DNA来结合要扩增的目标分子。这些末端（被称为接头）可能给实验结果带来很大的变数。有些试剂盒产生的接头二聚体比较少，但测序偏好比较大。有些试剂盒提供的接头更随机化，可能与某些miRNA结合得更好。“这些因素会使结果产生较大差异，导至难以重复的结果，”Van Keuren-Jensen说。

实验技巧：Laurent指出，减少样本批次、尽量由同一个人操作有助于降低结果的差异性。使用内参（比如不受疾病影响的一种RNA）是提高结果可重复性得另一条途径。在没有一个通用标准的情况下，“设立内参可以帮你去除产量或批次差异带来的许多影响，”Laurent说。Van Keuren-Jensen建议大家在论文中分享自己所用的试剂盒和分离方法，因为这些信息对实验结果的重复很有帮助。

监控exRNA只需要采集血样，不像肿瘤活检那么有风险，成本也比较低。不过从血浆或血清中分离exRNA仍有一定的挑战性，一方面是因为exRNA丰度低，另一方面是因为血液中的污染物会抑制PCR。商品化的试剂盒能简化和加速exRNA提取过程，已成为循环exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人横向评估这些试剂盒的提取效率如何，是否能去除血浆中的污染物，是否会偏向特定的RNA。而这类评估对于结果解释和实验之间的比较都很关键。

来源：生物通