肿瘤标志物的检测及临床应用

检验医师

【摘要】肿瘤标志物是瘤组织表达的生物活性物质、特异性酶类，异位性蛋白，以及激素等。随着PCR、基因芯片、蛋白芯片色谱／质谱等现代化科学技术的发展，肿瘤标志物的检测方法、肿瘤标志物的种类越来越多，肿瘤标志物的检测能力亦大大提高。肿瘤标志物不仅包括传统的血清中的蛋白、糖类，还可能是肿瘤组织细胞表面的蛋白、基因及microRNA。多种肿瘤标志物的联合应用，极大地提高了肿瘤的筛选、早期诊断和预后判断的灵敏度及特异性。

肿瘤标志物是能够体现肿瘤发生和发展的特异性物质，一般为肿瘤细胞及相关组织中表达的分子，也可能是肿瘤发生时表达水平异常的物质，主要包括在癌症前期、早期和转移过程中肿瘤组织表达的生物活性物质、特异性酶类，异位性蛋白，激素等。肿瘤标志物对肿瘤的筛选、诊断和判断预后具有重要意义，目前有关肿瘤标志物的研究已成为恶性肿瘤诊疗领域的热点。近年来，大量文献报道了肿瘤相关标志物及检测方法，目前应用于临床的亦很多。本文就目前国内外临床开展的、有可能进入临床的肿瘤标志物及相关检测方法进行综述，以供参考。

一、肿瘤标志物的检测方法

由于肿瘤标志物检测主要用于肿瘤的筛查、早期诊断、肿瘤疗效监控、活动性和并发症评估以及随访等目的，因此肿瘤标志物的检测要求具备简便、快捷、无损伤、量化易于动态监测，兼顾灵敏度及特异性等特点。目前肿瘤标志物的检测标本主要包括血清、肿瘤组织两大类。检测方法主要包括如下四类：

1　免疫发光测定   免疫发光测定(Chemiluminescent Immunoassay， CLIA)是Halman于1977年建立的方法。其基于放射免疫分析的基本原理，将发光物质或酶标记在抗原或抗体上，免疫反应结束后，加入氧化剂或酶底物而发光，通过测量发射光的强度，根据标准曲线测定待测物的浓度。有研究指出：从酶免疫测定、荧光免疫测定发展到发光免疫测定，使最低检出值的灵敏度提高了10 000倍。CLIA具有两种类型：间接式(有标记)和直接式(无标记)。虽然CLIA可能遇到诸如外界光线的干扰、迟钝的反应时间和试剂相遗漏等问题，但其能对抗原-抗体的相互作用进行实时检测，仪器价格低廉，可实现自动化，使用简便、安全、无放射性污染，成为了标记免疫分析的一个重要方向，是目前广泛应用于临床实验室检测肿瘤标记物的方法。检测标本主要为血清，指标包括癌胚抗原(CEA)、糖抗原(CA19-9)、癌抗原(CA125)、甲胎蛋白(AFP)、前列腺特异抗原(PSA)、糖抗原CA15-3、人绒毛膜促性腺激素(hCG)等。

2、基因检测  基因检测方法在蛋白水平上包括免疫组织化学法immunohisto-chemisty，IHC)、酶标免疫法(enzyme linked immunosor-bent assay，ELISA)；DNA水平上包括荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridis-ation，FISH)、色素原位杂交(chromogenicin situhybridization，CISH)和非荧光原位杂交、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCＲ)等。 IHC使用特异性抗体，检测细胞表面蛋白表达情况的方法。其检测结果易受多种外界因素的影响，准确率不如FISH检测，但IHC具有操作简便、价格低廉等优势，成为临床上初筛的首选方法。ELISA用于检测血清中肿瘤标志物的蛋白表达水平，可实时检测表达、用于术后检测。FISH是将标记荧光的探针与检测的DNA结合，以碱基配对的原则形成杂交体，检测基因扩增情况的新技术。FISH法是被广泛认定的用于检测肿瘤标志基因过表达的金标准，较之其他检测方法，它能给出明确、客观的阴性或阳性结果。但因其操作流程复杂以及价格昂贵，故临床上主要作为进一步确认的方法。CISH作为一种核酸原位分子杂交技术方法，也可用于常规甲醛固定的石蜡组织切片中肿瘤标志基因的检测。关于CISH法、FISH法及IHC法比较的研究较多，目前认为CISH法和FISH法检测一致率达到96%。由于CISH法对实验条件及操作人员的要求较FISH低，如果准确性进一步提高，则有可能取代FISH法成为基因检测的常规方法。此类检测在病理标本检测肿瘤标注物中常用，如从乳腺癌组织中检测HER-2/neu基因等。此类肿瘤标志物的检测往往与肿瘤治疗方法、治疗药物的选择密切相关。

3、微阵列系统   随着技术的发展，要求同时测定血液或其它组织中多种分析物的要求在医学研究中日益明显。因此，在发展高通量分析方法的努力下，能够研究功能和表达蛋白组学的蛋白微阵列系统(Microarray System)发展起来。微阵列系统不仅可以允许对小型样本中多种标志物进行高通量的测定，而且还可以显著地减少测定所需的时间，为提高肿瘤标志物的辅助诊断价值，进行肿瘤标志物的联合检测提供了可能。目前，对肿瘤标志物的联合检测有两种不同的意见，一种是通过严格筛选、科学分析后进行肿瘤标志物的组合，以有针对性地进行检测，避免卫生资源的浪费和加重病人的经济负担；另一种是利用生物芯片技术，将目前能用于诊断的肿瘤标志物尽可能地点在一张芯片上进行检测，以充分获得信息，提高诊断的灵敏度。但无论是哪一种意见，快速、准确地检测出肿瘤标志物都是其存在的前提。微阵列系统在一定程度上，检测目标蛋白需要选择合适的捕获分子。因此，新的快速生产许多特异抗体和不同类型捕获分子的方法孕育而生。其与传统的肿瘤标志物免疫测定相比较，在对肿瘤的系列标志物检测时具有更好的实用性。

4、表面增强的激光解析/电离化飞行时间质谱（surface-en-hanced laser desorption/ionization-time of flight mass spectrome-try，SELDI-TOF-MS）  SELDI-TOF-MS原理是通过亲合作用，蛋白质结合到芯片的化学或生物位点上，激光脉冲使芯片中的分析物解析形成荷电子，由于各种蛋白质的分子量及所带电荷的不同，在仪器场中飞行的时间长短不一，质量较轻的离子飞行速度快，较早到达检测器，较重的离子飞行速度慢，较晚到达检测器，由此得到质谱图，经计算机软件处理可形成模拟质谱图，同时直接显示样品中各种蛋白的分子量和含量等信息。与疾病蛋白质谱图进行数据检索处理，能够发现和捕获新的特异性相关蛋白。SELDI-TOF-MS技术检测范围广泛，可检测尿液、血清、培养细胞、组织提取物等，可进行特定蛋白质表达物的识别、药物筛选、测定血清中的小分子物质，尤其在癌症及遗传性疾病相关蛋白的识别上取得了一系列突破性进展：如老年痴呆、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌等。

二、恶性肿瘤中常用的肿瘤标志物及组合

1、肺癌：肺癌的发病率持续上升，早期不易被发现，术后情况较差，5年生存率只有10%左右。目前用于诊断肺癌的常用肿瘤标志物包括：TSGF、CEA、NSE、SCC、CA125、Cyfra21-1。血清TSGF是恶性肿瘤特有的生长因子，只促进肿瘤的血管增生，而不作用于肺肿瘤的血管。因此，若血清TSGF含量升高，有利于恶性肿瘤的早期诊断；CEA是最具典型的一种癌胚蛋白，属于免疫球蛋白，在机体发生肿瘤的过程中，包括生长和转移，都作用在癌细胞与癌细胞或基质胶原之间，因此，机体若发生癌症反应，该指标含量会明显升高；NSE是一种存在于哺乳动物组织内的一种糖酵解酶，存在于神经内分泌细胞中，可以特异性的作为神经细胞的标志性指标。由于小细胞肺癌主要为神经内分泌类细胞，因此NSE水平明显增高，对诊断、病情监测和疗效判断有较高的临床应用价值；SCC是由鳞状上皮细胞产生的一种抗原，因此可作为分属于鳞癌的一类特异性标志物。但是SCC对肺癌的敏感性不高，但特异性强，常作为鉴别肺部恶性疾病和良性疾病的特殊血清标志物指标。其半衰期不长，在手术治疗后的2-3 d内即可消失，但若再次升高，常提示再度复发或癌细胞转移，是早期复的良好监测指标。在上世纪90年代国外学者率先研究得出：肺癌患者预后可用血清CA125浓度测定来参考，且研究显示处于肺癌中晚期肺癌患者血清CA125的含量明显升高，而生存时间也明显短于水平正常者。可以作为患者评价预后的一项指标；Cyfra21-1是角蛋白家族中最小的成员CK1片断，其在体内的分布很广，包括正常组织表面，特别是支气管表皮细胞等，该指标在肺癌患者体内含量尤其高。因此，常用来动态监测肺癌治疗效果。目前认为Cyfra21-1是检测肺鳞癌的首选指标，可鉴别良性肺病和正常人。研究发现上述血清肿瘤标志物联合检测并动态观察，可互相弥补不足，最大限度提高肺癌诊断的灵敏度、特异度及准确度，有利于肺癌的早期诊断、疗效观察和预后的评估。

2、消化道肿瘤： CA19－9对胆管癌以及胰腺癌敏感度较高，AFP则对肝癌敏感性高，CA72－4对胃癌敏感度高；对于部分消化道肿瘤，肿瘤标志物单项检测有效性以及灵敏度与联合检测相比较均显著降低(P均＜0.05)，但部分联合检测的特异性有一定下降。对于胰腺癌、胆管癌以及结肠癌，CEA联合CA19－9、CA50为首选检测标志物；对于胃癌，CEA联合CA19－9、CA72－4、CA242可作为首选标志物；对于肝癌，CEA联合AFP是首选标志物。胰腺癌及结肠癌术后几种标志物水平均有下降，术后1.5个月CEA与CA19－9恢复趋于正常。最新研究表明外周血样本中的microRNA-23b在胃癌组、癌前病变组和对照组表达阳性率分别为71.7%、32.1%和3.8%，胃癌组的阳性率显著高于癌前病变组，其阳性预测值为76.7%％，阴性预测值为77.2%，因此胃癌患者外周血中microRNA-23b表达水平可反映患者病情的进展程度，且其诊断效率较高，有望成为用于胃癌早期筛查的新型分子标志物。NSE、CYFRA21-1、CEA  3种标志物的联合检测对于食管癌的诊断有较高敏感性以及特异性( 81.9%、83.3%)，可以作为食管癌诊断的辅助指标，能有效提高食管癌诊断的敏感性。

3、前列腺癌：常用肿瘤标志物指标包括癌胚抗原、前列腺特异抗原、前列腺特异膜抗原及前列腺特异性酸性磷酸酶。研究发现四种肿瘤标志物在前列腺癌患者血清中的水平显著高于健康人群，其中前列腺特异抗原阳性率为96.7%，前例腺特异膜抗原阳性率为98.3%，前列腺特异性酸性磷酸酶阳性为96.7%，癌胚抗原阳性率为93.3%。然而良性病变患者血清中也可发现单个肿瘤标志物的水平升高，因此在前列腺特异抗原升高的基础上，联合其他几种标志物结果进行综合分析，可保证诊断的敏感性与特异性，同时对预后进行评估，提高临床治疗效果，延长患者生存时间，具有确切的应用价值。

4、妇科肿瘤：宫颈癌预后的相关分子标记物包括：维甲酸受体(retinoic acid receptor，RAR)、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF)、信号转导与转录因子5(signal transducers and activators of transcription，STAT5)等。维甲酸(retinoic acid，RA)又称视黄酸或维生素A酸，是维生素A的衍生物，通过和维甲酸受体结合到DNA应答元件，调控靶基因的转录和表达，在机体生长发育、细胞分化过程中发挥广泛效应，与肿瘤的发生发展及预后有密切的关系。MMPs属于依赖锌的内肽酶家族，具有降解细胞外基质的作用。肿瘤细胞脱离原发灶，需要突破细胞外基质及基底膜屏障，继而向邻近组织浸润、远处转移，细胞外基质及基底膜降解是肿瘤浸润转移过程中关键的步骤。肿瘤组织中MMPs的表达量明显高于正常组织，与肿瘤的侵袭和转移密切相关。VEGF是一种多肽类细胞因子，具有高度特异性的有丝分裂原，通过增加血管内皮细胞的增殖、迁移和新生血管的形成，促进肿瘤发生发展，是最具有代表性的刺激血管生成的因子。在宫颈鳞癌组织中，VEGF-C的阳性表达率为82.6%，正常宫颈组织的阳性表达率为20.0%，且VEGF-C的阳性表达与临床分期、淋巴结转移有关。STAT 5是STAT家族的成员之一，在调节细胞增殖、分化及肿瘤相关信号途径中发挥重要作用。这些分子对判断宫颈癌的复发、转移、预后有一定的参考价值。CA125、CA199、AFP、CEA联合检测，可以提高未成熟性畸胎瘤的灵敏度，但降低了特异度和总正确率，对于鉴别诊断成熟性与具有一定临床价值。子宫、卵巢肿瘤可首选CEA、CA19-9与CA125组合。

5、乳腺癌： HER-2/neu是表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor，EGFR)家族的成员之一，对细胞的生长、分化及凋亡起重要的调节作用。HER-2/neu参与抑制细胞的凋亡，维持或促进肿瘤细胞的生长，增强肿瘤细胞的侵袭和转移，破坏机体组抗侵袭屏障的能力。HER-2/neu基因在正常组织中不表达或微量表达，在乳腺癌、结肠癌等恶性组织中可大量表达，目前用于乳腺癌及结肠癌的诊断治疗中。TSGF、CA153和CEA对乳腺癌的敏感性为76.9%、69.2%和20.0%，特异性为64.8%、91.3%、和92.0%。联合检测乳腺癌的敏感性为87.7%，特异性为89.5%，对乳腺癌的诊断具有重要意义。

随着PCR、基因芯片、蛋白芯片色谱／质谱联合应用等高通量技术的发展，肿瘤标志物的检测能力已大大提高，越来越多的肿瘤标志物被发现被应用于临床。实现多种肿瘤标志物的联合检测，可以提高肿瘤检测的灵敏度和特异性，对肿瘤的筛选、早期诊断和预后判断提供帮助，最终提高临床治疗效果，延长患者生存时间，降低肿瘤患者的死亡率。

作者：薛红  李卫东

空军航空医学研究所附属医院