室间质评之分子病理FISH检测标准化

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什么是室间质评

室间质量评价或简称室间质评（EQA）是利用实验室间的比对来确定实验室能力的活动，实际上它是指为确保实验室维持较高的检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动。

国内现状

为推动国内分子病理实验室的规范化发展并促进院间相互交流，国家卫生和计划生育委员会病理质控评价中心（PQCC）于2015年组织开展了PQCC示范实验实评选专项活动；内容为ALK基因重排和HER2基因扩增的FISH检测，其中ALK基因重排检测共83家单位参与，合格率为93.8%，HER-2基因扩增检测共124家单位参加，合格率90.9%；结果表明，经过多年的努力，各实验室的FISH检测能力均得到了良好的发展，但在参加本次室间质控的单位中也有近10%的实验室没有通过，这个数字不可小觑，试想这些没有成功获得认证的单位，今后的工作如何开展，FISH检测项目是停止还是继续，谁也不知道，如果继续采用现有的实验流程及判读标准，如何对病人的检测报告负责，这个问题值得我们思考。

如何解决

导至FISH检测室间质评差异化明显的原因，无外乎两方面，FISH实验操作及结果判读。笔者走访过北京及周边的几家单位，比如：协和医院，医科院肿瘤医院，北京肿瘤医院，307医院，同仁医院，辽宁医学院附属第一医院等，这些医院在此次室间质评中均得到了优秀的成绩，他们成功的关键主要是“FISH标准化”，具体体现在这两个方面：

1. FISH操作流程标准化

2. FISH结果判读标准化

“标准化”是博朗生公司一直向广大病理同仁们大力推介的方向，现由病理柳叶刀在这两方面分别向各位做一展示 ：

一FISH操作流程标准化

FISH操作步骤繁琐，主要包括样本前处理，酶消化、变性杂交、洗脱等，每位老师在每个步骤都有自己的操作习惯，拿脱蜡后的预处理来说就有三种以上的方法，高压法，化学法，高温常压法等，这就不难解释为什么FISH开展了这么多年，还有近10%的单位没有通过室间质评了；如何做到标准化，减少人为操作是必须的，目前有条件的医院为避免人为操作的影响，从仪器平台到试剂做了多方面投入和改进。

1、FISH自动化仪器平台

减少人为操作误差，提高FISH检测的成功率，标准化sop操作，重复性稳定性好，目前主流高大上FISH自动化产品有两大平台：

A. Abbott自动化平台

B. Leica Biosystems

2. 应用FISH标准化试剂：

各单位开展FISH分子检测，所用FISH探针必须符合CFDA认证，这是毋庸置疑的，但整个FISH操作过程，FISH探针的使用只是最后一步，各位老师们在其他环节对试剂的使用方法是层出不穷，比如酶处理这一步，用到了蛋白酶，胰酶和胃蛋白酶，且各种活力单位，不同浓度轮番上阵，这样如何标准化？更别提准确诊断，精准医疗啦。那么是否有一款试剂适合我们的所有FFPE样本的FISH检测中的处理消化洗脱步骤呢，而且最好可以通用于自动化平台和手工FISH检测呢，答案是肯定哒，此次通过ALK和HER2基因的室间质评的单位就用到了两家公司的试剂：

a. Paraffin Pretreatment Kit II，Paraffin Pretreatment IV and Post-Hybridization Wash Buffer Kit（雅培公司）

b.原位杂交样本预处理试剂（金箓公司，注册证：浙绍械备20150041号）

两款试剂盒均能用于FISH样本前处理，同时适用于自动化仪器（VP2000，ThermoBrite Elite等）和手工操作，制备3～5um石蜡切片，烤片后进行常规脱蜡步骤，之后就可以按如下流程进行实验了：

Ⅰ 预处理（15分钟）

a) 在80℃预处理液中处理15分钟；

b) 取出玻片，纯水处理1分钟，取出后小心吸去玻片上的残余溶液。

Ⅱ 酶消化(30分钟，根据玻片厚度或样本类型可调整消化时间)

a) 将玻片置于蛋白酶溶液中37℃消化30分钟；

b) 纯水浸泡1分钟；

c) 70%，85%，100%乙醇脱水各1分钟；

e) 室温干燥玻片，备用。

Ⅲ 加探针共变性杂交过夜

Ⅳ 杂交后的洗涤

1、 挪去树胶，放入室温的杂交后洗液Ⅰ浸泡除去盖玻片

2、 取出玻片，放入73℃杂交后液Ⅱ染色缸中，漂洗2分钟。

3、 取出玻片，暗处直立风干

风干的杂交玻片，滴加适量DAPI复染剂，之后就可以观察了，这个过程中，商品化试剂盒中包含的：预处理液、蛋白酶、洗液，提高了实验的重复性，稳定性，成功率。也就达到了FISH流程的标准化。

二FISH结果判读标准化

（一）、根据最新版乳腺癌NCCN指南2015V.2 HER-2检测原则，对FISH判读标准进行以下图文说明：

HER2基因扩增FISH判读标准中值得注意的是：

• 随机计数至少20个浸润癌细胞核的双色信号；
• 所计数的扩增细胞应为均质，连续且占浸润癌的10%以上；
• HER2基因扩增计数不必考虑信号点之间的距离，有明确信号即可计数；
• 若众多HER2信号连接成簇时，可不用计数，直接视为基因扩增；也可按照成簇信号是单个信号几倍来计数。
  
  

（二）肺癌ALK结果判定：

ALK基因断裂重排检测FISH判读标准中值得注意的是:

1.信号重叠、相邻或分开距离小于2个信号点直径，未发生重排属于阴性；

2. 除融合信号外，出现单个绿色信号，表明橙色信号靶区域缺失，也判读为阴性结果；

3. 阳性结果包括：细胞核内出现单个的橙色信号时，或者绿色橙色信号之间距离大于2个信号点直径，提示有断裂重排发生；

4. 阴性阳性细胞核常发生多拷贝信号。

FISH诊断技术将在很长一段时间内作为病理科分子病理的诊断平台，推动精准医疗的发展，标准化不可忽视，严格遵循上述指南和标准是非常必要的，推动FISH实验流程及结果判读标准化，能从根本上提高我们的诊断水平，也只有这样我们才能得出真实可靠的结果，给临床以正确的指导意义。期待各位在下次PQCC室间质评中都能取得优秀的成绩！

来源：病理柳叶刀