细胞周期流式检测步骤详解

流式小生

材料与试剂：

全称	简称	货号
PBS		——
乙醇，70-80%,提前放置-20°C预冷	固定剂	——
BD Pharmingen™ stain buffer, or equivalent, 1X PBS, 2% FBS, 0.1% NaN3 (pH 7.1–7.4)	染色液	554656
BD Pharmingen™ PI/RNase staining buffer (for PI/Rnase staining)	PI/RNase染色液	550825
BD Pharmingen™ 7-AAD (7-Amino-Actinomycin D) staining solution (for 7-AAD staining)	7-AAD染色液	559925

使用说明：

DNA染料，尤其是PI，具有较强的粘性。样本上机检测之后，应遵照仪器说明书仔细清洗流式细胞仪，以免对下一位操作者结果造成影响 。

固定好的细胞可保存长达12个月 (储存于70-80% 的乙醇，置于 -20°C保存).

操作步骤：

1. 收获细胞于流式管中，加入3-4ml的PBS清洗细胞。
2. 1000rpm离心10分钟，弃上清。
3. 逐滴加入5ml或更多预冷的70-80%的乙醇，涡旋混匀细胞， 4°C避光过夜（>18小时）。
4. 1000-1500rpm 离心细胞10分钟，弃上清。之后清洗细胞2次以去除所有的乙醇。
注：第一次用1x PBS，第二次用染色液（货号：554656）。
5. 细胞染色：每管样本需10^6细胞。具体操作如下：
1) 对于PI/RNase 染色，将细胞重悬于0.5 mL PI/RNase 染色液（货号：550825）。
2) 对于7-AAD染色，将细胞重悬于0.1 mL 染色液（货号：554656），同时加入20 μL7-AAD染色液（货号：559925）
6. 室温避光孵育15分钟。
7. 分析前4℃避光保存样本。1小时之内上流式细胞仪检测。

样本制备注意事项：

• 获得单个细胞，尽量避免DNA的降解
• 样本最关键的就是减少碎片（EDTA/不可过度吹打/离心rpm）
• PI既能与DNA结合，又能与RNA结合，所以要用RNase降解
• PI质量及RNase所加量很重要，建议用商品化试剂
• 污染脱氧核糖核酸酶会降解DNA，故玻璃器皿和试剂要干净灭菌

样本检测注意事项：

• 进样速度：一般检测细胞浓度调整为2E5–2E6/ml，进样速度为低速。若峰形较宽，可能就是进样速度太快
• 仪器质控定期做，尽可能排除因机器设置引起的峰形加宽
• 排除粘连细胞（FL2-A/FL2-W）
• 通过电压脉冲信号的宽度和面积区别实体组织标本中的粘连细胞群体，最大程度的减少粘连细胞带来的假阳性结果

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