黑色素瘤的分子病理诊断和个体化治疗进展

检验之星

根据美国国立癌症中心的统计数据，在2014年的新发恶性肿瘤中，黑色素瘤约占4.6％，美国目前有黑色素瘤患者约92万名，每年死亡人数超过9000名。最近几十年间，黑色素瘤的患病率和死亡率均有明显的增加。由于黑色素瘤的组织学形态多种多样，遇到疑难病例，即使是有经验的病理医师也难以仅凭组织学形态做出明确诊断。

随着分子病理的飞速发展，分子诊断在黑色素细胞病变的诊断和治疗过程中扮演着越来越重要的角色，除了协助诊断，还能明确基因突变的位点，了解黑色素瘤的特异性遗传学改变，为黑色素瘤患者的个体化治疗提供有价值的信息。我们总结了黑色素瘤中的特征性基因突变、分子检测方法及最新的个体化治疗进展，同时重点阐述了BRAF和KIT基因突变及荧光原位杂交（FISH）检测在黑色素瘤诊治中的作用。

一、黑色素瘤中的关键分子通路

1.BRAF

BRAF是丝氨酸／苏氨酸激酶，在神经组织、黑色素细胞以及睾丸和造血组织的细胞中均可见BRAF的高表达，通过形成异源或同源二聚体活化，参与细胞增殖。一般情况下，该酶的活性由ＲＡＳ增强，通过细胞外信号调节激酶（ERK）负反馈抑制。随后，BRAF磷酸化激活丝裂原活化蛋白激酶（MEK），MEK作为BRAF的唯一底物，可激活细胞的有丝分裂原激活蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）信号转导通路，促进细胞增殖（图１）。

BRAF突变是黑色素瘤中最常见的突变，约见于５０％的病例，其中８０％～９０％的BRAF突变位于第600位密码子，原有缬氨酸被谷氨酸取代，通常标记为BRAF V600E，这一替换导至MARK／ERK通路激活，从而促进细胞增殖。第二种最常见的突变形式是BRAF V600K（赖氨酸取代缬氨酸），在黑色素瘤BRAF基因突变中约占１０％。其他的BRAF基因突变所占比例很小（＜１％），因此，病理分子检测中主要针对BRAF V600E和V600K。许多良性色素痣中同样可检测到BRAF突变，有报道，后天获得性痣可达７９％，结节性痣可达５０％，这些伴BRAF突变的痣绝大多数和慢性日光性皮损无关。在日光性皮损相关性痣，如黏膜及肢端的色素痣中极少见到BRAF突变。

有人推测BRAF突变和色素痣形成的始动环节有关，可促进痣的生长，也有报道称BRAF与ｐ１６同时突变可引起黑色素细胞的恶性转化。目前发现年龄是BRAF突变的黑色素瘤的高危因素之一，＜５５岁的患者BRAF基因突变的检出率更高，有报道显示BRAF突变的黑色素瘤与年龄呈负相关。很多学者发现黑色素瘤的BRAF突变与多种组织学表现相关，BRAF突变的黑色素细胞更大更圆，色素更多，更容易成巢和向上扩散。

而且，与无突变黑色素瘤相比，BRAF突变的黑色素瘤与周围未受累的皮肤组织分界更清晰，病变处表皮的增厚更明显，但肿瘤本身的厚度和表皮是否有溃疡形成与BRAF突变并无相关性。对比BRAF V600E型突变和其他突变的临床特点，发现大部分非V600E型的黑色素瘤与慢性日光性皮损相关，且患者年龄偏大，如V600K突变的黑色素瘤多同时伴有日光性弹力组织变性。这提示与常见的V600E型突变不同，V600K的突变可能与慢性辐射损伤有关。

近期有学者发现与野生型黑色素瘤比较，BRAF突变型的黑色素瘤总体及预后效果较差，但以往的研究并未发现其对无远处转移生存或无病生存的影响。比较不同类型的BRAF突变发现，与V600E黑色素瘤相比，V600K突变的黑色素瘤首次转移前的无病间期较短，但总体生存率上并无差别。由于V600K突变的黑色素瘤患者患病率低，所以针对该突变对黑色素瘤预后影响的研究还很有限。如前所述，非V600E突变与慢性晒伤关系密切，可能涉及慢性辐射损伤相关的BRAF突变机制。因此，很有必要进行深入研究，以揭示不同类型突变对患者预后的影响。

2.KIT

KIT是一种跨膜糖蛋白，分布于细胞表面，属于Ⅲ型酪氨酸激酶家族，配体为干细胞因子（stem cell factor，ＳＣＦ）。KIT在正常的黑色素细胞周期中扮演非常重要的角色，通过与相应的配体ＳＣＦ结合形成二聚体，激活酪氨酸激酶，通过自身磷酸化进一步磷酸化激活下游各种效应子，完成多种信号的传递，包括MAPK通路及Ａｋｔ／ＰＩ３Ｋ通路等，最终活化胞质内的转录因子，从而调控基因表达、细胞生长和增殖。KIT基因异常包括突变和扩增，两者既可单独存在，也可同时出现。虽然KIT突变仅占所有黑色素瘤的３％，但在慢性日光皮损相关的黑色素瘤、肢端及黏膜等特定部位的黑色素瘤中，KIT突变的发生率可达２３％。尽管这些病例中已知BRAF或ＮＲＡＳ基因突变，KIT检测仍然非常必要，因为结果有助于预测黑色素瘤的进展、远期转移和生存期。在黑色素瘤中最常见的KIT突变位点为外显子１１的Ｌ５７６Ｐ和外显子１３的Ｋ６４２Ｅ，但KIT基因突变具有明显的异质性，黑色素瘤中的KIT突变分布于外显子９、１１、１３、１７和１８，因此KIT突变检测时需要检查所有这些外显子的序列。

二、黑色素瘤其他分子通路

1.NRAS

ＮＲＡＳ突变与先天性色素痣相关性最强，尤其是那些直径较大的痣（＞１.５ｃｍ），研究发现在大约５５％的先天性色素痣中可检测到ＮＲＡＳ突变。最常见的突变形式是外显子３的氨基酸置换，包括Ｑ６１Ｋ和Ｑ６１Ｒ，约占ＮＲＡＳ突变的６５％。检测ＮＲＡＳ突变的意义在于ＮＲＡＳ优先激活ＣＲＡＦ而不是BRAF，这可以解释为什么有些色素痣不发生BRAF突变，可能通过ＮＲＡＳ激活ＣＲＡＦ途径导至黑色素细胞的增生，因此，临床也尝试通过ＣＲＡＦ抑制剂诱导黑色素瘤细胞的凋亡。最近的一项二期临床研究显示，MEK１／２抑制剂对大约２０％的黑色素瘤患者部分有效。

2.HRAS

目前研究发现在黑色素细胞病变中，ＨＲＡＳ突变多见于Ｓｐｉｔｚ痣中，之前研究发现大多数伴有１１ｐ获得的Ｓｐｉｔｚ痣与ＨＲＡＳ突变相关，而后者被发现位于第１１号染色体的短臂。ＨＲＡＳ突变与先天性痣、后天获得性痣或发育不良型痣的关系尚未检索出报道。

三、染色体异常

１．ＦＩＳＨ技术在诊断黑色素细胞病变的临床应用

ＦＩＳＨ技术在疑难黑色素细胞病变的诊断中发挥越来越重要的作用，借助ＦＩＳＨ检测可明确鉴别病变的良恶性质。目前，多探针ＦＩＳＨ检测是辨别黑色素细胞病变良恶性相对客观可靠的方法。临床上最常用的ＦＩＳＨ筛查试剂盒采用第６号染色体上三个基因靶点６ｐ２５／ＲＲＥＢ１、６ｑ２３／ＭＹＢ和第６号染色体着丝粒，以及第１１号染色体１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１）靶点的组合，应用这个组合试剂盒进行黑色素瘤鉴别诊断的敏感性达８７％，特异性达９５．４％。ＦＩＳＨ检测的问题在于结果的解读。

例如由于切面的缘故而导至计数错误，因此ＦＩＳＨ结果计数时一定要保证足够数量的肿瘤细胞。如果送检的肿物非常小，没有足够可计数的细胞核，这时依靠ＦＩＳＨ的诊断就会非常困难。有时肿瘤细胞密集，细胞核相互重叠也会造成计数错误。此外，有的研究应用２９％的细胞阳性作为判定点，而有的研究应用３８％的细胞阳性作为判定点，不同的判定标准必然导至不同的研究结果。尽管如此，ＦＩＳＨ检测仍旧是现阶段鉴别黑色素细胞病变良恶性的重要辅助手段。有研究报道ＦＩＳＨ的阳性预测值大约为６２.５％，阴性预测值为８０.７％，这就提示我们应用ＦＩＳＨ鉴别黑色素细胞病变的良恶性时一定要结合组织形态。该作者认为阴性的ＦＩＳＨ结果相对比较可靠，而遇到和形态学相左的阳性结果时，一定要谨慎对待，不能一味依赖ＦＩＳＨ结果做诊断。新近的报道发现，黑色素瘤存在遗传异质性及与克隆无关的转移病灶，这意味着在转移性黑色素瘤的克隆进化中，遗传性分化并不少见。在鉴别模棱两可的黑色素细胞病变时，组织学形态相比ＦＩＳＨ有更高的敏感性（９５％比４３％），特异性差（５２％比８０％），但二者结合时敏感性和特异性均明显升高（分别达７６％和９０％）。因此，鉴别黑色素细胞病变良恶性时，ＦＩＳＨ只作为辅助手段，一定要结合组织学形态。

２．染色体片段的增加或缺失

多项黑色素瘤研究通过ＦＩＳＨ检测发现多种染色体的获得或缺失，而这些染色体异常并不出现在良性痣中。常见的染色体异常位于６ｐ、１ｑ、６ｑ及９ｐ。分子病理检测相关的染色体异常对明确黑色素瘤的诊断和了解预后具有非常重要的意义。６ｐ的增加见于３０％的黑色素瘤，常提示预后较差，而且与组织学形态上较厚的肿瘤相关，在薄层型的黑色素瘤中没有查到６ｐ的异常。１ｑ的增加见于约２５％的黑色素瘤，也提示预后较差，但多见于薄层型的黑色素瘤。６ｑ的缺失见于２８％的黑色素瘤，临床主要用于鉴别良性Ｓｐｉｔｚ痣。第１０号染色体缺失见于６３％的黑色素瘤，由于良性Ｓｐｉｔｚ痣同样没有这种染色体异常，故而也用于鉴别形态类似黑色素瘤及Ｓｐｉｔｚ痣。应用６ｐ２５（ＲＲＥＢ１）的增多检测黑色素瘤具有较高的敏感性（约７３％），相比单独用第６号着丝粒（ＣＥＰ６）的检测敏感性大大增高。６ｑ２３（ＭＹＢ）和ＣＥＰ６的联合使用也大大提高敏感性。６ｑ２３（ＭＹＢ）的缺失在黑色素瘤中的检出率大约２４％，ＭＹＢ常常和ＲＲＥＢ１联合用于检测黑色素细胞病变的良恶性。第３号染色体单体的异常见于５０％的葡萄膜黑色素瘤，具有该染色体异常的患者转移几率大大提高，相对无该染色体异常的患者，疾病相关的死亡率也自１３％提高到７５％，故而在葡萄膜黑色素瘤中检测该染色体异常非常重要。与此同时，有研究表明如果第３号染色体异常同时伴有第８号染色体的丢失，则肿瘤转移的几率增加。９ｐ的丢失和遗传性黑色素瘤综合征相关，有研究发现９ｐ２１的丢失多见于细胞增殖型的黑色素瘤，该染色体异常多提示较好的预后。９ｐ的丢失大约见于８０％的黑色素瘤，由于类似的染色体异常在发育不良的痣中也有报道，所以这种丢失或许是黑色素

细胞病变发展的早期基因学改变。

四、分子检测和靶向治疗

１．BRAF的检测和靶向治疗

BRAF基因突变通过传统的Ｓａｎｇｅｒ测序法检测，这种检测方法将不同颜色荧光标记的双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）混入含有普通脱氧核苷酸三磷酸（ｄＮＴＰ）的反应池。ｄｄＮＴＰｓ因缺少３′端羟基而阻断ＤＮＡ复制，单个ｄｄＮＴＰ结合到ＤＮＡ合成片段末端即能终止复制。得到的不同长度ＤＮＡ片段因迁移速度及荧光标记不同，通过凝胶电泳可推测出ＤＮＡ的碱基序列。最近的一项研究显示罗氏公司的ＣＯＢＡＳ ４８００可能是一种较灵敏的检测方法。该方法能检测到不同的BRAF基因突变（V600E和V600K），但即便是这种先进的方法，也只能检测５０％的V600K基因突变，如果Ｖ600基因突变发生频率过低的话也无法被检测。在这项检测方法中，目的基因得到扩增并结合荧光标记探针，而只有在探针与目的基因结合时下才会发出荧光，分离时则荧光信号丢失。检测荧光反应量并将之绘制成与温度对照的曲线，将荧光信号丢失二分之一时相对应的温度定义为解链温度（Ｔｍ）。通过图表分析解链温度曲线即能够准确检测突变的ＤＮＡ。采用免疫组织化学染色检测BRAFV600E也是一个不错的选择，有研究显示其敏感性为９７.３％，特异性为１００％。免疫组织化学检测所有的Ｖ600突变时，敏感性下降至９１％，对该抗体结果的标准化解释或许会给抗体的应用带来广阔的前景。现阶段临床推荐所有晚期黑色素瘤（不能手术切除的Ⅲ期和Ⅳ期）患者进行BRAF Ｖ600突变检测，以便指导BRAF抑制剂的合理使用。最近，两种BRAF抑制剂，维罗菲尼（ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）和达拉菲尼（ｄａBRAFｅｎｉｂ）在治疗BRAF V600E突变的黑色素瘤都显示出５０％～６０％的反应率，同时使患者获得更长的无进展生存期。这两者都是ＡＴＰ的竞争剂，选择性抑制BRAF，相对野生型ＢＦＡＦ，它们与突变的BRAF亲和力更强。最初，两种抑制剂的临床试验仅选择V600E突变的患者；然而，新的证据表明其他发生率较低的BRAF突变的患者同样能从治疗中受益。最近有关达拉菲尼和维罗菲尼的研究也开始在评估这些药物对非V600E突变患者的疗效，结果没有证据表明BRAF抑制剂对BRAF非突变患者有效。但值得注意的是，BRAF野生型的黑色素细胞经过BRAF抑制剂处理后仍处于持续激活的状态，因此，将黑色素瘤的BRAF突变进行分类非常必要。

这种反常激活也见于约四分之一接受BRAF抑制剂治疗后发生鳞状细胞癌和角化棘皮瘤的患者，由此有人提出，BRAF抑制剂作用于ＲＡＳ突变的角质细胞，可促进细胞增殖；在小鼠模型中，在ＲＡＳ突变和BRAF抑制剂同时存在的情况下，细胞系中MAPK途径被反常激活，非黑色素瘤的皮肤癌会加速生长。而在相同情况下，加入MEK抑制剂可显著抑制这些肿瘤的发生发展。使用BRAF抑制剂的一项Ⅰ期临床试验选择了３２例V600E突变的患者，其中８１％的患者显示完全或部分的反应率。另一个涉及１３２例治疗后的Ｖ600突变患者的Ⅱ期临床试验中，５３％的患者证实有确定的治疗效果，６％患者的肿瘤症状完全缓解，仅１４％的患者出现疾病进展，中位生存期为１５.９个月。在针对６７５名V600E患者的Ⅲ期临床试验中，比较维罗菲尼和达卡巴嗪（ｄａｃａｒｂａｚｉｎｅ），经维罗菲尼治疗的患者肿瘤体积明显减小，维罗菲尼治疗患者的有效率为４８％，而达卡巴嗪治疗的有效率仅为５％。经过维罗菲尼治疗患者的死亡风险相对降低６３％，接受BRAF抑制剂治疗后，随着肿瘤的缩小，肿瘤内浸润的ＣＤ４＋和ＣＤ８＋的淋巴细胞显著增加。此外，BRAF抑制剂并未对免疫反应产生不利影响，这有利于对抑制剂和免疫制剂联合使用进行研究。迄今为止，临床试验数据表明达拉菲尼是非常有效的。在晚期黑色素瘤患者中，达拉菲尼被证明比达卡巴嗪更加有效（改善无进展生存率和总体治疗有效率），并且对颅内病变的患者也有效。

２．KIT的检测和靶向治疗

由于KIT筛查需检测所有的外显子，做一个检测费时费力，所以为了提高效率和资源合理配比，只有BRAF阴性的肢端或者黏膜黑色素瘤患者才推荐进行KIT的全外显子筛查。如果将来找到对应特定治疗的KIT检测靶点或许能够降低KIT检测的花费和难度。关于KIT突变的相关治疗，已明确证实KIT抑制剂甲磺酸伊马替尼可有效治疗胃肠道间质瘤和白血病。２０１３年ＮＣＣＮ治疗指南中将甲磺酸伊马替尼作为KIT突变的转移性黑色素瘤的指导用药。有研究显示甲磺酸伊马替尼只对KIT外显子１１或１３突变者有效，所有治疗有效的患者包含Ｌ５７６Ｐ或Ｋ６２４Ｅ的突变，而前者位于第１１号外显子，后者位于第１３号。正确识别这些致瘤突变，寻找意义更明确的检测点，或许会帮助我们找到更特异的KIT抑制剂。除了KIT突变，多项试验都证实单纯的KIT扩增应用KIT抑制剂无效。

３．ＮＲＡＳ

在应用ＮＲＡＳ抑制剂的治疗中，针对ＮＲＡＳ的小干扰ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）可抑制黑色素瘤细胞系的增殖，同时提高肿瘤细胞对化疗的敏感性。研究显示，脂肪酸转移酵素抑制剂（ＦＴＩ）可通过阻断ＲＡＳ翻译后修饰的关键酰化步骤而抑制ＲＡＳ的激活。替吡法尼（ｔｉｐｉｆａｒｎｉｂ）作为ＦＩＴ的一员，在治疗转移性黑色素瘤的一组单药、单臂Ⅱ期临床试验中，

由于最先入组的１４例患者的无效结果导至试验提前终止。目前尚缺乏ＲＡＳ特异的抑制剂，针对ＲＡＳ通路中伴随因子的抑制剂的研究或许能够解决问题。

五、靶向治疗的耐药性和抑制剂的联合治疗

１．抑制剂治疗的耐药性

BRAF抑制剂治疗黑色素瘤的有效性已经公认，但肿瘤完全缓解的例数很少。通过研究黑色素瘤细胞对抑制剂的逃避，研究者发现了许多BRAF抑制剂的耐药机制。有些黑色素瘤的耐药性是通过重新激活MAPK途径，研究显示抑制剂治疗后的黑色素瘤出现ＮＲＡＳ、ＣＲＡＦ和MEK的突变和／或过表达。通过研究BRAF突变的黑色素瘤细胞系，发现抑制剂处理后，细胞系通过ERK激活介导的耐药性的产生并不依赖于BRAF的活性。只有在通路中的三种ＲＡＳ亚型均被抑制的时候，ERK的激活才能被成功抑制，提示这些肿瘤细胞能够在不同的ＲＡＳ亚型间进行内部转换从而保持持续的异常增殖。在相同细胞系的研究中还发现，抑制MEK是阻止细胞增殖的有效途径。另一个明确的耐药机制与ＣＯＴ的表达有关，ＣＯＴ蛋白也通过ERK的活化重新激活MAPK途径从而引起细胞增殖。此外，黑色素瘤还可通过激活ＡＫＴ途径逃避抑制，在文献中描述了两种机制：第一种是血小板源性生长因子受体β（ＰＤＧＦＲβ）的上调，第二种是胰岛素样生长因子１受体（ＩＧＦ-１Ｒ）的表达增加。这两种跨膜蛋白通过激活ＰＩ３Ｋ（磷脂酰肌醇-３激酶）从而激活ＡＫＴ途径引起抑制剂治疗耐药。虽然使用BRAF抑制剂治疗时疾病进展后并未检测到新的BRAF突变，但最近的研究发现了一种新的耐药机制，BRAF的剪接变异体ｐ６１BRAF（V600E）在伴低水平活化的ＲＡＳ时或经过维罗菲尼处理后，均会出现二聚体增强。有关KIT抑制剂治疗黑色素瘤的耐药机制研究非常有限，胃肠道间质瘤治疗的耐药机制则相对较多，但大多数试验中并未将患者按KIT外显子突变类型进行分类，正如文章前面所述，现阶段KIT抑制剂治疗非外显子１１、１３突变和仅有KIT扩增的黑色素瘤是无效的。

２．抑制剂的联合治疗

现阶段的研究已经发现黑色素瘤有多种方式对抗抑制剂的治疗，随着时间的推移，我们将会发现更多的耐药机制，随着靶向治疗的蓬勃发展，准确检测特定类型的分子异常，明确判断肿瘤的耐药机制越来越重要。与此同时，正如大多数恶性肿瘤的治疗方案涉及多种方法联合一样，黑色素瘤的治疗也不例外。采用MAPK和ＡＴＫ通路的抑制剂联合治疗黑色素瘤仍处于研究阶段，目前的结果好坏均有。在联合治疗中，有报道发现了针对BRAF和MEK联合抑制的交叉耐药，今后还有可能出现更多交叉耐药。临床应用中发现采用BRAF抑制剂加上MEK抑制剂或哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（ｍＴＯＲ）抑制剂的联合疗法能克服黑色素瘤细胞系对BRAF抑制剂的耐药性。曲美替尼是一种MEK的抑制剂，和V600E／Ｋ突变患者的常规化疗相比，联合使用可以延长无进展生存期和患者的总生存期，而且对BRAF Ｌ５９７Ｓ突变患者也有效。转移性黑色素瘤患者经过BRAF和MEK抑制剂联合治疗，相对单一药物治疗，患者的无进展生存期明显延长。在联合治疗中很重要的一类是抑制剂和免疫治疗药物联合，在最近的研究中，有证据表明应用伊匹单抗（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）可有效治疗KIT突变的黏膜黑色素瘤，而且没有研究显示KIT突变的黑色素瘤对免疫治疗无效。研究者建议当黑色素瘤患者的一般情况良好时首先应用免疫治疗，在免疫治疗基础上合并KIT抑制剂，或许会带来更好的临床疗效。

综上所述，虽然黑色素瘤尤其是临床晚期的黑色素瘤仍是恶性程度很高的肿瘤，分子病理检测和基因靶点治疗药物的蓬勃发展使我们在攻克这一顽疾的道路上取得了很多实质性的进展。BRAF和KIT突变的靶向药物的使用为很多患者带来了可预期的临床疗效，但是越来越多的研究也揭示了不同的黑色素瘤的逃逸机制和目前检测手段中的不足。结合临床资料，应用合理的检测，明确分子亚型，筛选靶向治疗人群均是黑色素瘤个体化治疗的关键。

来源：中华病理学杂志   作者：程亮