影响糖化血红蛋白测定的因素及实验室检测注意事项

检验医师

糖化血红蛋白A1c（hemoglobin A1c，HbA1c）是评价糖尿病血糖控制水平的首选指标，并且与糖尿病慢性并发症的发生和发展密切相关。近年来，许多国家糖尿病学会和WHO推荐将其作为糖尿病的首选诊断标准，拓宽了HbA1c的应用范围。然而在某些特定的情况下，尤其是当病人有血红蛋白变异体存在时常导至HbA1c测定结果的极度异常或与血糖水平不一致，甚至误导临床；而且多种因素可致HbA1c出现假性升高或降低，不能准确反映糖尿病病人血糖控制状况，影响临床诊断和治疗。本文简要讨论糖化血红蛋白的生物化学特性，重点介绍糖化血红蛋白的测定方法、血红蛋白变异体对HbA1c测定的干扰，以及引起HbA1c假性升高或降低的因素，并提出实验室检测注意事项。一、HbA1c的生物化学成人血红蛋白（hemoglobin，Hb）通常由HbA（97％）、HbA2（2.5%）和HbF（0.5%）组成。在健康人，几乎94%的HbA是非糖化的血红蛋白即HbA0，而6%的是糖化血红蛋白（glycated hemoglobin,GHb）即HbA1。HbA1又包括HbA1a、HbA1b 和HbA1c，前二者含量较少约占GHb的1%，HbA1c是主要的糖化血红蛋白，约占GHb的5%。HbA1a又由HbA1a1和HbA1a2组成，两者分别是血红蛋白β链N-末端与1，6-二磷酸果糖和6-磷酸葡萄糖发生糖基化作用的产物，HbA1b是血红蛋白β链N-末端与丙酮酸的结合物，HbA1c由葡萄糖与血红蛋白β链N-末端的缬氨酸残基缩合而成。HbA1c的形成主要依赖血糖浓度和红细胞寿命。全部过程经历两个非酶促反应：第一步是快速反应期，葡萄糖粘附在血红蛋白N-末端的缬氨酸残基上，形成一个不稳定的醛亚胺中间产物即Schiffs碱；第二步是Schiffs碱经历漫长的葡糖胺（Amadori）重排反应形成稳定的酮胺化合物即HbA1c；或逆向转变成葡萄糖和血红蛋白。由此可以看出，HbA1c与血液中葡萄糖浓度密切相关，因红细胞的平均寿命是120d，理论上HbA1c可反映过去120d血糖的平均水平，但在红细胞120d寿命中，近期血糖水平对HbA1c的检测值贡献更大，标本采集前30d的影响达50%，而采前集第31～90d的影响为40%，而91～120d的影响仅为10%，因此，HbA1c检测主要反映过去2～3月的平均血糖水平。红细胞寿命受基因学、血液学和相关疾病等因素的影响，当解释临床结果时必须考虑这些因素，特别是能改变红细胞生成和红细胞结构的因素，临床医生应知晓这些因素可能导至HbA1c假性升高或降低。二、HbA1c的测定方法目前，市场上供实验室选用的测定HbA1c 的方法至少有3 0 余种，主要分为两大类：一类是基于糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，目前常用的有离子交换层析法（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）；另一类是基于糖化与非糖化血红蛋白的结构差异，这一类包括免疫测定法（immunoassays，IA）、酶法（Enzymatic assays，EA）和亲和层析法（affinitychromatography，AC）。不同方法采用的原理不同，所测组分不同，但均可以按照国际临床化学和检验医学联合会（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，IFCC）的参考测量程序进行标化。（一）基于电荷差异的测定方法1.阳离子交换HPLC法：是国内外最常用的分析方法，以Bio-Rad和TOSOH等厂商生产的糖化血红蛋白分析系统为代表。其基本原理是：糖化与非糖化血红蛋白所带电荷不同，对阳离子交换树脂（带负电荷）的吸附能力不同，选择洗脱缓冲液的离子强度与pH，不同组分的血红蛋白HbA1a、HbA1b、HbF、HbA1c、HbA0和HbA2依次被洗脱，得到血红蛋白各组分的层析图谱。样本中HbA1c的浓度可用下式计算：GHb（HbA1c）% =GHb（HbA1c）/ΣHbA，ΣHbA包括糖化的和未糖化的HbA各组分。HPLC法最突出的优点是具有优良的精密度，而主要缺点是易受血红蛋白变异体的干扰导至HbA1c假性升高或降低。2.CE法：这是近年来发展起来的一种新技术，以法国Sebia公司的CAPILLARY 2 FP毛细管电泳仪为代表，其基本原理是：不同蛋白质分子在特定pH值缓冲液中所带电荷不同，通过高电压，在电渗流和电场力作用下的泳动速率也不同，从而使糖化和非糖化血红蛋白得以完全分离，从阴极到阳极依次为HbA2/HbC、HbES/HbD、HbF、HbA0、其他血红蛋白（包括少量HbA2）和HbA1c，按下式计算出HbA1c含量：HbA1c（%）=HbA1c/（HbA1c+HbA0）。该法具有良好的精密度和正确度，不受常见血红蛋白变异体的干扰，而且可以用毛细血管血进行测定。（二）基于结构差异的测定方法1.IA法：包括免疫比浊法和胶乳凝集抑制法。该法利用抗原抗体的特异性结合反应测定GHb，以Hbβ链糖基末端最初的3～5个氨基酸残基作为抗体识别位点，制备相应的单克隆抗体。免疫测定法的优势是可在普通的生化分析仪上完成，快速简便，易于批量检测，临床应用广泛。其主要缺点是不精密度相对较大，常见血红蛋白变异体可影响检测结果。2.EA法：样本溶血后在蛋白酶的作用下释放出糖化缬氨酸，同时通过测定Hb的吸光度，求出血红蛋白浓度。糖化缬氨酸在果糖缬氨酸氧化酶的作用下生成过氧化氢，后者在辣根过氧化物酶催化下与色素原反应产生颜色变化，颜色的深浅与HbA1c浓度成正比。此法适用于各种自动化分析仪。2014年，雅培公司使用果糖基二肽氧化酶在Architect生化分析仪上建立了一种新的HbA1c酶测定法，该法批内和日间CV均小于1.2%，线性范围达19mmol/mol(3.9%)～163mmol/mol(17.1%)，与HPLC法有很好的相关性，结果与IFCC法一致，氨基甲酰血红蛋白、甘油三酯和胆红素等不干扰测定。3.AC法：该方法测定的是总GHb，包括HbA1c和酮胺结构。凝胶柱中的琼脂糖被羰基二咪唑激活后与间氨基苯硼酸相连，而硼酸可与整合在Hb上的顺位二醇作可逆性结合，因此GHb与亲和树脂结合，再用反式多元醇配体-山梨醇洗脱，通过检测415nm波长处的吸光度值来量化糖化和非糖化成分。该法不受血红蛋白变异体、HbF和氨基甲酰血红蛋白的干扰，对于血红蛋白变异体携带者长期以来一直被当作参考方法。John等对基于HPLC硼酸盐亲和层析原理的Trinity Biotech Premier Hb9210糖化血红蛋白分析仪的分析性能进行了多中心评价，参加的实验室多数为IFCC和NGSP参考实验室网络成员，以SI单位表示时，HbA1c低、中、高值的变异系数CV分别为2.71%、2.32% 和2.14%，若以NGSP单位表示则分别为1.62%、1.59% 和1.68%，均明显低于IFCC推荐的上限3%和NGSP的上限2%，具有较宽的分析测量范围，与目前常用的HbA1c测定方法以及IFCC参考方法之间均具有很好的相关性，常见的血红蛋白变异体HbC、HbS、HbE和HbD不干扰测定。（三）POCT测定法在过去的几年中广泛使用POCT的方法测定HbA1c，POCT法主要基于亲和层析分离或免疫测定法的原理。POCT的优点在于可在操作者办公室手指采血并且能够给病人和操作者迅速反馈结果及时调整治疗方案，主要缺点是重复性差，与参考方法的偏差较大，不同批号的结果一致性差，而且基于免疫学原理的POCT法受血红蛋白变异体的干扰。总之，POCT 的质量目前尚难保证，其检测性能不足以满足临床需求。使用POCT的操作者应确保其检测结果与NGSP认证实验室有可比性。（四）测定方法的标准化HbA1c 检测方法众多，结果差异较大。为了解决HbA1c 检测结果的溯源性和可比性，美国（National Glycohemoglobin Standardization Program, NGSP）于1996年开始致力于GHb的标准化研究工作，要求全美临床实验室的检测结果均应溯源至美国糖尿病控制和并发症临床试验（Diabetes Control and Complications Trial，DCCT）和英国糖尿病前瞻性研究（the United Kingdom Prospective Diabetes Study，UKPDS）的研究结果上，指定在DCCT和UKPDS研究中所使用的Bio-Rex 70树脂HPLC法为参考方法。通过NGSP认证的实验室，HbA1c水平至少有0.5%的变化被认为是具有统计学和临床意义。目前，美国绝大多数实验室的检测结果均可溯源至DCCT，实现了HbA1c检测结果具有可比性的目标。与此同时，1995年，IFCC成立了一个工作组致力于糖化血红蛋白标准化的研究工作，首先完成了HbA1c的定义，然后基于新的定义研制了校准品，并建立了参考方法，这种新方法已经被包括欧洲、美国、日本、中国在内的10余家IFCC国际参考实验室验证。NGSP的HbA1c测定结果以百分数报告，而IFCC结果使用国际单位（International System of Units，SI）报告，即以mmol A1c/molHbA来表示。NGSP和IFCC的值呈线性关系，使用主回归方程两个系统的值可以相互转换。ADA、欧洲糖尿病研究会（EASD）和国际糖尿病联盟（IDF）等发表了一致性声明，要求同时使用NGSP（%）和IFCC（SI）单位报告结果。IFCC的新定义是：人体血液中的葡萄糖与血红蛋白β链N-末端缬氨酸残基以共价键结合的稳定的已糖化合物，全称为血红蛋白β链-N-1-脱氧果糖-血红蛋白。新的定义排除了葡萄糖与血红蛋白β链赖氨酸残基以及与血红蛋白α链任一氨基酸的结合物。而通常所说的GHb是指一个或更多个糖分子不可逆地结合在血红蛋白任一蛋白链的任一氨基酸上，包括HbA1c。IFCC参考方法包括与内蛋白酶Glu-C共孵育、清除β链氮端的六肽、用质谱法或毛细管电泳法分离、定量糖基化以及非糖基化的六肽。参考物质为人血液中提取的纯化HbA1c和 HbA0混合物。三、血红蛋白变异体对HbA1c测定的干扰（一）常见的血红蛋白变异体迄今发现最为常见的血红蛋白变异体是HbS、HbE、HbC和HbD，全球范围的分布规律为HbS＞HbE＞HbC＞HbD，这四种变异体均由血红蛋白β链一个氨基酸被替换而生成。HbS即镰形红细胞血红蛋白，β链第6位的谷氨酸突变为缬氨酸，纯合子携带者表现为严重的镰形红细胞贫血。HbE是位于β链第26位的谷氨酸突变为赖氨酸，纯合子携带者通常无贫血症状。HbC系位于β链第6位的谷氨酸突变为赖氨酸；纯合子携带者通常血红蛋白含量正常或有轻度贫血，HbSC携带者常有轻至中度的慢性溶血性贫血。HbD是位于β链第121位的谷氨酸突变为谷氨酰胺，其携带者常有轻度溶血性贫血。大部分血红蛋白变异体的杂合子通常无症状，红细胞生存率正常，如果糖尿病患者同时携带血红蛋白变异体基因，不易引起临床医生的注意。（二）血红蛋白变异体对HbA1c测定的干扰1. 阳离子交换HPLC法：通常HPLC法最易受血红蛋白变异体的干扰，这种干扰可能引起HbA1c的极度异常或HbA1c测定值与血糖浓度不一致。在使用HPLC法时，由于血红蛋白变异体与HbA1c共洗脱可导至HbA1c假性升高产生极度异常结果，例如：HbI变异体与HbA1c共洗脱可致HbA1c升高至25%以上，HbK Woolwich、Hb Hope、Hb Camden等变异体与HbA1c共洗脱可致HbA1c升高至45%以上。很多变异体的形成是α或β链的一个中性氨基酸被一个带正电荷的基团取代，这种改变降低了非糖化血红蛋白变异体的洗脱时间，使其与HbA1c一起洗脱，导至HbA1c的检测值假性升高，甚至高达54%，如Hb Raleigh、Hb Graz、Hb Sherwood Forest、Hb South Florida等。若血红蛋白变异体的突变发生在氨基端则使得乙酰化血红蛋白在体内更容易形成，乙酰化HbA在某些方法中与HbA1c一起洗脱，使用这些方法检测时也会导至HbA1c假性偏高。在某些情况下，血红蛋白变异体与HbA共洗脱，但糖化的变异体与HbA1c完全分离，从而导至HbA1c假性降低，如HbD、Hb G philadelphia、Hb J Baltimore、Hb Opadove等。迄今为止，已发现对HPLC法干扰的血红蛋白变异体至少有27种。而最常见的血红蛋白变异体对大多数方法不产生干扰，NGSP网页含有更新血红蛋白变异体对不同方法干扰的信息，临床和实验室人员可随时查阅。通常Hb变异体与HbA1c一起洗脱或是分离取决于使用的方法。这些不一致的结果的产生是因为使用了不同的溶液、分析柱、温度、压力、流速、洗脱时间。因此同一变异体使用不同方法得出的HbA1c结果可能存在很大差异。2. IA法：由于HbS和HbC的突变位点靠近β链的氨基末端，一些基于免疫学原理的分析方法如雅培Architect/Aeroset系统、贝克曼AU系统、西门子Advia系统等会受这两种变异体干扰，而HbE和HbD的突变位点距β链氨基端较远，不影响免疫学方法。当有HbK Woolwich、Hb Hope、Hb Camden等变异体存在时，免疫测定法受这些变异体的干扰使HbA1c测定值低于4%，与血糖浓度不一致，其原因可能是变异血红蛋白干扰变异体β链与抗体的结合。其它变异体如Hb Graz、Hb Raleigh、Hb Raleigh也可使免疫法的结果假性降低。免疫测定法易于受HbF的干扰，其原因是定量测定HbA1c的大多数抗体识别的是血红蛋白β链N-末端第5或6位糖化氨基酸，而HbF在这些位点的氨基酸组成发生了改变，因此抗体不能识别糖化的HbF，而定量总血红蛋白的试剂能同时测定HbA和HbF，故导至HbA1c假性降低。3.AC法：由于硼酸盐亲和层析法可将糖基化血红蛋白与非糖基化血红蛋白分离，与血红蛋白的种类无关，通常不受血红蛋白变异体及其衍生物的干扰，因此在评价血红蛋白变异体对某一方法的干扰时常作为参比方法。有研究报道使用Abbott IMX系统测定HbAC样本时HbA1c有正向偏倚，该系统使用的是硼酸盐/阳离子捕获法，推测导至该偏倚的原因可能系聚阴离子捕获试剂与非糖化HbC分子6号位的赖氨酸替换发生反应所致。4.CE法：迄今为止，尚未发现Schiffs碱，氨基甲酰血红蛋白，常见的血红蛋白变异体如HbS、HbD、HbC、HbE，升高的HbA2和HbF对HbA1c测定有干扰。Dessi等对6例HbAS杂合子的HbA1c检测结果显示，毛细管电泳法与Variant ⅡHPLC法结果一致，但G8 HPLC法明显降低；此外，1例HbD变异体患者VariantⅡ法HbA1c测定值为681mmol/mol（97.3%），使用相同的分析仪器但校准品、质控品、运行时间和分析软件不同，测定结果为76mmol/mol（10.8%），而毛细管电泳法和G8法分别为75mmol/mol（10.7%）和48mmol/mol（6.8%）。结果提示，当有血红蛋白变异体存在毛细管电泳法的结果更可靠。四、引起HbA1c假性升高或降低的其他因素（一）HbA1c假性升高任何延长红细胞寿命或减少红细胞在高糖环境中暴露时间的因素均可引起HbA1c水平增高，缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是最常见的引起HbA1c增高的因素。研究证明，与OGTT相比，HbA1c对IDA伴有糖尿病的病人诊断特异度明显降低。先前的研究显示，伴有和不伴有糖尿病的贫血病人经治疗后HbA1c明显降低，但最近的研究表明，伴有DM的IDA病人经治疗后HbA1c明显升高，其确切的机制尚需进一步研究。其他引起HbA1c假性升高的情况还包括维生素B12和叶酸缺乏性贫血、无脾症等。严重的高甘油三酯血症（浓度＞1750mg/dL）、严重的高胆红素血症（浓度＞20mg/dL）和尿毒症均可引起HbA1c假性升高。当实验室的组合中有其中一项并包括HbA1c测定时，临床医师应考虑作出标记标明HbA1c测定结果不可靠，以避免将来参考此结果时引起误导。数种治疗药物和化学物质可引起HbA1c假性升高，包括铅中毒、长期饮酒、服用水杨酸盐和阿片类药物。当用电泳法测定HbA1c时，服用维生素C可引起HbA1c假性升高，而使用色谱法时则引起HbA1c假性降低，此可能是通过竞争机制抑制了糖基化作用所致。尽管在每天摄入维生素C 1g，持续3个月时可以看到这种影响，这也是多数病人的常规剂量，但其研究对象为非糖尿病病人，因此临床关联性还不清楚。（二）HbA1c假性降低任何能缩短红细胞寿命或减少红细胞在高糖环境中的暴露时间，增加红细胞周转的因素均可造成HbA1c水平降低，这些因素如急性或慢性失血、溶血性贫血、脾脏肿大等均可造成HbA1c结果假性降低。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷可导至糖化血红蛋白降低，也有研究报道，G-6-PD缺陷是2型糖尿病的风险因素之一。通常，慢性肾病的病人HbA1c结果假性降低。这最初是由于随着红细胞生存的减少引起的慢性贫血有关，然而，包括促红细胞生成素治疗和高尿素血症的存在等多种因素的相互作用产生不同的效果进一步影响HbA1c。总之，在终末期肾病的病人，倾向于低估病人的平均血糖浓度，临床医生应考虑使用血糖控制的替代指标。在妊娠初期，HbA1c不能真实地反映血糖水平，因为红细胞寿命由约120d减少到90d左右，同时促红细胞生成素产生增加。HbA1c值在孕12-16周进一步降低，直到孕20-24周停止。HbA1c水平在妊娠9个月又重新开始升高。因为在妊娠期间HbA1c水平通常假性降低，故不能用于诊断妊娠糖尿病。反而，OGTT试验可以用来筛查和诊断，在妊娠期间的血糖管理应首先确定使用自我血糖监测。影响HbA1c假性降低的补充品和治疗药物包括维生素E、病毒唑和α-干扰素。维生素E每天剂量达到600-1200mg即可减少蛋白质的糖化作用，而病毒唑和α-干扰素能够引起可逆的溶血性贫血。五、实验室检测注意事项1.选择合适的测定方法。糖化血红蛋白测定方法众多，不同方法，原理不同，其影响因素也不相同。检验人员应了解检测方法对于各种变异体检测的局限性以及引起HbA1c假性升高或降低的因素，并在报告中为医生作出提示。在我国南方为地中海贫血和血红蛋白病的高发地区，应尽量避免选择基于电荷差异的离子交换HPLC法，若已经使用了此法，在发出报告前须仔细检查色谱图确认可能存在的血红蛋白变异体，以避免发出不准确的结果误导临床。在大多数情况下，检验人员如仔细阅读厂商提供的使用说明书可避免发出不准确的结果。为避免因血红蛋白变异体引起的差错，需要人工或通过计算机程序逐个检查有无异常色谱图，这就要求检验人员有特定的操作仪器的技能和具备判断图谱的能力。2.关注HbA1c的极度异常值以及HbA1c与血糖不一致的结果。在各种情况下，包括病人的自我血糖监测结果与HbA1c结果不一致、HbA1c＞15%、当改变了检测方法HbA1c结果与上次的结果出现明显差异、尿毒症病人全血细胞计数出现异常红细胞参数等均应怀疑有血红蛋白变异体的存在。若由于存在血红蛋白变异体干扰发出检验结果偏低的报告，会影响高血糖的监测和治疗，从而增大并发症发生的风险。若由于存在血红蛋白变异体的干扰发出检验结果偏高的报告，会导至过度治疗，从而增加低血糖发生的风险。因此，美国临床生化学会（NACB）要求当HbA1c＞15%或低于参考区间下限时应重复测定一次（最好用不同原理的方法），以确定是否有血红蛋白变异体的存在。3.合理解释特定病人的HbA1c检测结果。临床医生应清楚认识到某些药物会造成HbA1c假性升高或降低，其中部分药物在临床上使用十分广泛，对特定病人HbA1c结果解释也应该更加小心，这样才能避免潜在严重错误的发生。当用HbA1c评估铁、维生素B12或叶酸缺乏引起的贫血的糖尿病病人的血糖控制情况时，临床医生应充分考虑HbA1c结果可能存在假性升高，不能真实反映病人的平均血糖水平，在做出任何医疗改变前临床医生应要求病人在餐前和餐后2小时连续检测毛细血管血糖数天，评估血糖自我监测结果是否与期望的HbA1c水平一致，以避免潜在的不适当的治疗和降低低糖血症的风险。4.必要时选择替代指标。在HbA1c不能准确反映血糖控制的情况下，使用替代指标是合适的选择。这些指标包括果糖胺、糖化白蛋白、1,5-脱水葡糖醇（1,5-AG）和连续葡萄糖监测（continuous glucose monitoring，CGM）。尽管果糖胺、糖化白蛋白、1,5-AG和CGM检测与平均血糖水平相关，重要的是要记住只有HbA1c是通过验证证明可作为评价长期血糖控制和并发症形成风险的测量指标，因此HbA1c仍是测量血糖控制状况的金标准，这些替代方法只能用于HbA1c结果不准确或误导的情况，或对HbA1c进行补充。六、结 语HbA1c仍是糖尿病病人血糖控制的金标准，也可作为诊断标准使用。由于测定方法的标准化，临床医生可用HbA1c成功地诊断绝大多数的糖尿病病人、监测血糖控制和并发症形成的风险。然而，血红蛋白变异体对离子交换HPLC法的干扰不容忽视，对于血红蛋白变异体普遍存在的地区，应谨慎选择离子交换HPLC法测定HbA1c的检测系统，检验人员在发出检验报告前应认真检查色谱图，发现Hb变异体导至的异常结果或HbA1c与血糖浓度不一致时应用不同的方法重新测定。临床医生要牢记多数临床因素和药物可以造成HbA1c结果的假性升高或降低，在这种情况下，使用血糖控制的替代指标如果糖胺、糖化白蛋白、1,5-脱葡糖醇和CGM也许是更好的选择，但这些替代方法只能用于HbA1c结果不准确或误导的情况，或对HbA1c进行补充。

作者：中山市人民医院检验医学中心主任  张秀明