组织病理切片质量的影响因素

病理医师

1.组织的取材

取材时要注意及时快速固定，避免剪刀镊子损伤组织，组织要取全。全盘考虑进行病理切片的组织类型，病变可能累及的部位，组织包埋需要的剖面。

2. 组织的固定

在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是大体标本的保存，都必须进行及时的适当的和有效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导至失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。

固定的目的

①能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。

②保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。

③使组织硬化，便于切块。刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。

④对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。病理标本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。对于此类标本，应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在3-5天。

⑤可增强染色的作用。组织经过及时的固定，最终可见到切片有鲜艳的染色，而些时如果有一批未经及时固定的组织，将看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论，固定可以增强染色的作用。

固定的注意事项：

①组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。根据实验，如果要获得某些酶的染色，固定最好在组织离体后30秒至1分钟。对于其它达不到些要求是越快越好。原则上动物死亡后半个小时内取完并及时固定组织。

②组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。如果较大厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶了。因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材料再行固定，这是最佳的处理方法，如遇到胃肠的器官，则应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时，难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。

③对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。固定剂的种类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同。在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意的效果。对于肾，睾丸等泌尿系统和新生仔鼠应选择Bouin氏固定液。免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓冲甲醛；我病理室一般选择中性缓冲甲醛，它可以兼顾常规染色和免疫组织化学。

④组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。固定时间应根据取材大小、性质以及类型有关，视具体情况而定；时间太短，就不能很多的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以保证，固定时间太长，也不好。组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性。一般小鼠组织固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固定的成败。一般固定液和组织体积比为10：1~20：1之间。

⑥特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。

3. 常规石蜡切片制片过程

组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。制片过程的每一步每一环节处理不好都会影响切片质量。

组织脱水：

把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，至今为止，国内常用的都是酒精。因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。

每一步的组织脱水都需要控制好脱水时间，一般根据组织块大小和组织类型而定。短了脱水不干净，长了会使组织切片时易脆。

组织的透明：

组织脱水后，要经过一个浸蜡前的中间溶剂透明过程；才能进行浸蜡。透明的目的：组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，透明时间也不同。透明时间短了，透明不完全，导至切不了片，透明时间长了，透明过度，导至切片易粉易碎。

组织浸蜡： 　

用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（56～58℃），低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，避免组织收缩和变硬变脆有帮助，以尽量清除二甲苯蜡渗透到组织中起支撑作用，切片时才能把完整的组织和蜡一起完整切下来。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为1～3小时。浸蜡温度过高，浸蜡时间过长或不够均可导至组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。

组织包埋：　

组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（约3~5℃），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导至组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。组织包埋要选择所需要的组织切面。

组织切片： 　

组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，易于观察。切片的厚度应为3～4μ，组织蜡块过硬，切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成一截厚一截薄的现象。优质的组织切片要求切片较薄，平整，无刀痕，皱褶。切片太厚或呈波浪状厚薄不匀。

贴片烤片：

　  烤片时间短，会造成染色时切片从载玻片上脱落或脱蜡不净，染的切片会着色浅、不上色或灰染；烤片时间长，会造成对组织的损伤。

染色：

染色染色的程度包括脱蜡、浸水、染色、分化、促蓝、脱水、透明等过程。切片经过脱蜡至水，HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。要求组织结构清晰，色彩鲜艳，细胞核/细胞质对比分明。

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