每日一技术-杂交探针结合熔解曲线技术

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       分子信标探针（molecular beacon）是一种可以自发形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针，其5'末端标记有荧光基团，3'末端标记有淬灭基团，当茎环结构形成后，荧光基团和淬灭基团空间距离靠近，发生荧光共振能量转移（FRET），荧光基团被外界光源激发后发出的光子被淬灭基团吸收，此时探针不能被激发出荧光；若体系中存在与探针序列相匹配的模板，当分子信标探针于模板杂交后，其发夹结构被打开，使得荧光基团与淬灭基团空间距离增大，此时荧光基团被激发出的荧光未被淬灭，可以检测荧光信号；同时由于荧光强度与体系中的模板的量呈正比，故分子信标探针可以用于实时荧光定量PCR反应。
      当分子信标与模板链杂交后若继续升高温度可导至探针与模板再次分离，从而使得荧光强度随温度升高而降低。将荧光强度对温度变化时间求导数便得到了熔解曲线，熔解曲线的峰值为荧光信号降低速率最大时对应的温度，即为模板与探针结合强度（Tm值）。由于序列的差别，探针与野生型模板和突变型模板的结合强度有差别，表现在熔解曲线（溶解峰）的不同。
    探针溶解曲线技术将分子信标和延伸阻滞引物结合起来，并利用无5'-3'外切酶活性DNA聚合酶进行体外快速检测基因突变或SNP的技术。该技术具有高灵敏度、高特异性的特点，使检测结果更靠谱。
    延伸阻滞引物（Extension-Refractory primer）是一种可以和自身延伸产物形成“颈环”结构的引物，除了普通引物序列部分外，延伸阻滞引物5'端额外包含的一段碱基序列，这段序列可以与自身延伸得到的产物单链中包含突变位点在内的一段碱基序列互补，形成 “颈环”结构；由于野生型和突变型模板间序列的不同，故形成的“颈环”结构强度（Tm值）有明显差别。
    针对于野生型序列设计一条完全匹配的分子信标探针，并在探针的上下游设计一对高特异性引物，其中上游引物为普通引物，下游引物为延伸阻滞引物，在PCR体系中，上游引物浓度为延伸引物浓度的10倍，延伸阻滞引物的基础引物部分对野生型或突变性模板没有选择性，但其5'端额外序列部分只与野生型模板延伸得到的产物完全互补配对。在反应体系中加入引物对和分子信标探针，在PCR过程中，选择合适的退火和延伸温度，控制退火和延伸时间，探针与野生型模板结合强度高，可以较强方式结合，而探针与突变性模板不能完全互补配对（突变位点位置错配），故两者结合强度较低。同时延伸阻滞引物与野生型模板所得到的延伸产物可以形成“颈环”结构，而突变模板的延伸产物则不能；由于PCR反应所用的聚合酶缺少5'-3'外切酶活性，分子信标探针与模板的结合以及延伸阻滞引物二级结构的形成分别导至上游引物和延伸阻滞引物的延伸受到阻碍，这种阻碍作用主要对野生型模板起作用，而对突变性模板扩增几乎无影响，因此达到富集突变，提高灵敏度的作用。在PCR反应完成后进行溶解曲线分析，通过溶解峰的Tm值可以准确判断样本中是否发生了基因突变。
参考陕西北美基因股份有限公司相关专利

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一种利用探针熔解技术准确检测KRAS基因突变的方法.pdf(752.53K)以上为参考专利
相关类似技术还可参考厦门致善生物公司相关专利以及复旦大学《弹回探针引物技术》，相关资料可到**：寒武纪生物141477517下载，或回复主题帖向我发所有邮件huangchj03@126.com。