乳腺癌HER2 FISH检测——靶向用药的金标准 HER2检测方法比较

病理医师

HER2与乳腺癌

乳腺癌是女性恶性肿瘤中发病率最高的一种，正以每年3%～4%的速度急剧上升，已成为女性的第一杀手。临床上大约20-35%的浸润性乳腺癌存在HER2基因的扩增及蛋白的高表达。HER2基因(又名HER2/neu，c-erbB-2)位于17q12，是表皮生长因子受体（HER）家族成员之一，HER家族在细胞生理过程中发挥重要的调节作用。HER2编码相对分子量185KD的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性。HER2是重要的乳腺癌预后判断因子，HER2阳性（过表达或扩增）的乳腺癌，其临床特点和生物学行为有特殊表现，治疗模式也与其他类型的乳腺癌有很大的区别。

HER2检测方法有免疫组化（IHC）和荧光原位杂交（FISH）等。《2014年NCCN乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌HER2检测指南2014版》均强调：FISH是检测HER2基因状态的金标准。

一．检测意义

1. 判断预后：HER2阳性的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差。

2. 指导治疗：HER2基因扩增的乳腺癌患者对内分泌治疗药物（如他莫昔芬）产生耐药。HER2基因扩增的乳腺癌患者对CMF方案不敏感，宜采用大剂量蒽环类药物和紫杉醇类药物方案；HER2基因扩增的乳腺癌患者明显受益于Herceptin（赫赛汀，2001年FDA批准上市）等靶向药物治疗。

二．检测建议

IHC和FISH检测HER2的状态一致性很高，但也存在着差异，数据统计如下表1和表2示，对于IHC2+样本必须要用FISH进一步确认结果；3+直接为阳性，可不做FISH；0和1+，若条件允许，可再做FISH。

因此，《2014年NCCN乳腺癌临床实践指南》和《乳腺癌HER2检测指南（2014版）》均建议先进行HER2蛋白的IHC检测，IHC 2+样本进行ISH（FISH、DISH或CISH）检测。

三．样本准备：

1．标本类型：(1)手术切除标本；(2)粗针穿刺活检标本；(3)活检标本。

2．标本固定：所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定（1h内固定）。固定时应将标本每隔5～10mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以6—72h为宜。

3．固定液类型：4％中性(磷酸缓冲)甲醛固定液。

4．组织切片：(1)切片厚度3-5um；(2)应有HE染色切片作为对照。

四．临床上哪些患者需要进行HER2检测

1.所有乳腺原发性浸润癌都应进行HER2检测；

2.只要能获取肿瘤组织，对复发灶或转移灶也应该进行HER2检测；

3.如HER2检测结果为阴性，但疾病复发且生物学行为提示可能为HER2阳性肿瘤时，应重复HER2检测；

4.如HER2检测结果与组织病理学特征不相符时，如组织学分级为I级的浸润性乳腺癌HER2阳性，应重复HER2检测。

组织学1级的类型腺癌：

•浸润性导管或小叶癌，ER和PR阳性

•小管癌（至少90%为纯小管癌）

•粘液癌（至少90%为纯粘液癌）

•筛状癌（至少90%为纯筛状癌）

•腺样囊性癌（至少90%为纯腺样囊性癌）且常为三阴性

上一节，我们介绍了HER2检测方法，了解FISH作为金标准方法在HER2检测中的重要意义。这一节我们结合指南中HER2 FISH结果判读方法和临床经验，重点阐述结果判读的要点。

一．信号观察流程

  1.首先在HE/IHC切片上确认肿瘤区域；

  2.在10×物镜下，于FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构；

3.在40×物镜下扫描整张切片，观察是否存在异质性，要求至少找到2个浸润癌区域，计数至少20个浸润癌细胞。满意的标本应是75%以上癌细胞核中有杂交信号；

4.在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果进行信号计数，注意上下调整焦距，以免遗漏信号。

二．实验失败、不能判读的情况

1.因操作等原因，细胞核被损坏，边界不完整；

2.组织过度消化，细胞核边界不完整，DAPI染色浅；

3.组织消化不足，25%以上的细胞核无信号；

4.自发荧光很强或细胞核分辨差，10%细胞核外有信号。

三．计数要求

1.计数区域可结合苏木精伊红染色进行肿瘤细胞标识；

2.选择具较好核分界的区域，要求细胞核大小基本一致、边界完整，DAPI染色均匀、核无重叠，绿色着丝粒信号清晰；

3.随机计数确定的肿瘤区域中20～30个细胞核中的双色信号，不要主观选择信号多的核计数；

4.不要计数仅显示一种颜色信号的细胞核；

5.避免计数分裂像的细胞核或被细胞核分裂及边界不完整核；

6.如果2个同样大小的橘红信号之间距离不足一个常规橘红信号大小，只计为一个信号；

7.若红、绿两信号的比值>20或众多信号连接成簇时可不计数，视为基因扩增；

8.若为临界值，则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个观察者重新计数，如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明，或换其它方法或其它蜡块重新检测；

9.若HER2基因扩增在不同癌细胞中存在异质性时，应在另一癌区域再计算20～30个癌细胞核中的红、绿信号值，报告其最大值，并加以注释；

10.判读时可以将乳腺组织中的正常细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细胞)的HER2信号和CSP17信号作为内对照。

[摘自乳腺癌HER-2基因检测试剂盒（FISH法）说明书—AbbottMoleular Inc.]

四．结果判读

在清晰的肿瘤区域，按以上计数要求在至少20个核内计数GSP HER2（红色）和CSP17（绿色）信号，分别记录GSP HER2和CSP17的信号总数，再计算平均每个细胞HER2拷贝数、平均每个细胞CSP17拷贝数以及GSP HER2和CSP17比值。

注：a：对于HER2/CSP17比值≥2.0，但平均HER2拷贝数/细胞<4.0的病例是否应该视为FISH阳性目前尚存争议，建议对这部分病例在报告中加以备注，提示目前的争议，建议临床医师参考免疫组织化学检测结果并与患者进行必要的沟通；

  b：见于均质、连续的浸润细胞，且占浸润癌的10％以上

五．HER2 FISH判读标准的变化

新旧判读标准的比较：

①2014版新标准的截断值为2.0，2009版老标准的截断值为1.8和2.2；

②2014版新标准不只是HER2/CSP17的比值，需结合HER2基因的拷贝数进行判读；2009版则仅根据HER2/CSP17的比值进行判读，不考虑HER2基因拷贝数。

新旧判读标准衔接中可能出现的问题：

①2014版新标准出现HER2检测结果不确定的情况会比2009版标准更少；

②2014版新标准判读阴阳性结合了HER2基因的拷贝数，有些2009版标准判读结果为阴性的标本，如果HER2基因拷贝数≥6.0，2014版新标准则判为阳性。

[《乳腺癌HER2检测指南2009版》与《乳腺癌HER2检测指南2014版》]

这一节我们依据《乳腺癌HER2检测指南2014版》的要求，进行实例解析。

一．报告要求

《乳腺癌HER2检测指南2014版》要求检测报告包括如下内容：患者信息(包括姓名、

性别、年龄、门诊/住院号)、送检医师姓名、送检日期、标本信息(包括病理号和蜡块号)、标本部位和类型、探针信息、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果(包括评估的细胞数量、平均HER2拷贝数/细胞、平均CSP17拷贝数/细胞、平均HER2拷贝数/平均CSP17拷贝数的比值)、检测结论(如阳性、不确定、阴性、无法判读)。

这里强调两个概念：17号染色体计数和HER2异质性。

1. 17号染色体数目：FISH双探针检测系统中加入CSP17探针的目的是为了在检测HER2基因的同时检测17号染色体数目，从而区分17号染色体的非整倍体与HER2基因扩增。近年来的研究显示17号染色体多倍体与CSP17多信号点（着丝粒区多点）是不同的概念。17号染色体多倍体较罕见，而部分乳腺癌中17号染色体上存在HER2基因和着丝粒区的共同扩增。越来越多的学者认为，与GSP HER2/CSP17比值相比，HER2拷贝数对于HER2基因扩增的判断更为重要。因此在HER2FISH检测结果中除报告GSP HER2/CSP17比值外，还应分别报告HER2拷贝数和CSP17的数值。

2.HER2基因的异质性：浸润性乳腺癌中HER2表达或扩增可存在异质性。虽然HER2基因异质性的临床意义目前仍不明确，但它可导至IHC与ISH检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致。在ISH计数之前，应观察整张切片或使用IHC确定可能存在HER2扩增的区域。需要强调的是，即使存在异质性，但只要扩增细胞连续、均质，且占浸润癌10％以上，就应明确报告为ISH阳性。在报告中可补充报告不同细胞群(>10％)的计数值(包括计数的细胞总数、HER2拷贝数、CSP17数值、GSP HER2/CSP17比值)，并报告扩增细胞群占所有浸润癌细胞的比例。

二．常见结果及解释

注：对于HER2/CSP17比值≥2.0，但平均HER2拷贝数/细胞<4.0的病例是否应该视为FISH阳性目前尚存争议，建议对这部分病例在报告中加以备注，提示目前的争议，建议临床医师参考免疫组织化学检测结果并与患者进行必要的沟通

三．报告模板参考

1. 参考模板一

2. 参考模板二

本文转自“安必平”