关于讨论taqman探针法低拷贝模版灵敏度的问题

huangchj03

我这边遇到这样一个问题，现在也在努力的解决，就是我做的taqman试剂盒灵敏度偏低，采用染料法基本上可以实现2-5copies/反应，但是加入探针后只能达到20-50copies/反应，想了各种优化方法，怎么优化都提高不了太多，希望有人能出出主意，指点一下。

diana_zhang

个人认为检测的拷贝数偏低是不是引物设计的问题，因为在PCR中能够真正起到参与反应提高检测效率的还是上下引物。
TaqMan探针其核心是利用Taq酶的3’-5’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以，荧光信号的强弱就代表了模板的数量

huangchj03

diana_zhang 发表于 2015-1-7 08:52
个人认为检测的拷贝数偏低是不是引物设计的问题，因为在PCR中能够真正起到参与反应提高检测效率的还是上下 ...

我是采用探针的上下游做的染料法Q-PCR，灵敏度还可以，达到2-5copies/ul，这对引物没有二级结构，但是一旦把探针加进去灵敏度就下降10倍，引物的Tm基本上在58-59℃左右，探针的Tm值在primer expression 3软件上为65℃，宝生物合成单上显示62℃，我感觉是不是探针的Tm值有些偏低。

huangchj03

目前也看了很多相关专利，也给大家分享了，对这个问题的理解也清晰了一点儿，但是还是希望能有高人给与指点，交个朋友