结核病实验室诊断技术进展

检验医师

北京结核病控制研究所中心实验室主任  王甦民

结核病是一种由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，其发病规律和流行特点决定了在今后相当长的时期内其危害将持续存在。结核病被列为我国重大传染病之一，是严重危害人民群众健康的呼吸道传染病。世界卫生组织的统计资料显示，约三分之一的世界人口曾经感染结核菌，亚洲地区感染者占全世界的三分之二。据WHO估计，2007年全球约有927万新发结核患者，175万人死于结核病，我国是全球22个结核病流行严重的国家之一，同时也是全球27个耐多药结核病流行严重的国家之一。目前我国三分之一左右的人口已感染了结核菌，受感染人数超过4亿。据研究，受结核菌感染的人群中，10%的人会发展为结核病。我国现有肺结核病人约500万，主要集中在25岁及以上人群；每年约有13万人死于结核病，死亡平均年龄为55.2岁。如果不采取有效的控制措施，在未来的10年，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。

历年来全国结核病流行病学调查结果显示，全国肺结核患病率继续呈现下降趋势。特别是传染性肺结核患病率下降尤为明显，由2000年的122/10万下降到66/10万，十年降幅近50%。

结核分枝杆菌从分类上看是分枝杆菌科、分枝杆菌属中引起人类患病最多的致病菌。结核病实验室检查，尤其是细菌学检查是结核病诊断的最主要和最基本技术，也是选择治疗方案、考核疗效、评价防治效果的主要指标。

目前结核病实验室检查技术包括：全菌体为基础的病原微生物学检测、细菌核酸为靶标的分子生物学检测和机体免疫相关反应及其产物的检测。

一、全菌体为基础的病原微生物学检查技术

与其它传染性疾病相同，从检测原理和临床检验目的上，结核病的病原微生物学检查，分为基于形态学的显微镜镜检、基于微生物表型的分离培养、药物敏感性实验和菌种鉴定实验。

1. 分枝杆菌形态学检查——抗酸染色镜检：是结核病临床诊断最基本的方法之一，简单快速，在不考虑生物安全防护的前提下，２-４小时即可发报告，对于结核病的诊断、指导和评价临床用药具有重要意义。

从玻片制备操作流程的角度，抗酸染色可分为直接涂片和集菌涂片两种，其中直接涂片应用最为广泛。按照抗酸染色使用染料的性质和镜下成像原理，抗酸染色可分为萋-尼氏染色（Ziehl-Neelsen staining）和荧光染色（fluorescent staining）。使用石碳酸复红染料的萋-尼氏染色镜检是经典的抗酸菌检测方法，目前国内外多数实验室仍然依靠此方法进行结核检测，但其灵敏度较低，仅20%~30%；以金胺O、罗丹明为代表的荧光染色法提高了镜检的灵敏度，并使读片时间大大缩短。但由于荧光显微镜昂贵的价格，限制了其在基层的应用。

近年随着发光二极管（light emitting diodes，LED）与荧光显微镜技术结合，研发的发光二极管荧光显微镜较普通荧光显微镜有诸多优势：LED灯泡不需要定期维护，寿命约为50000h，光的强度容易调节，甚至可以转为荧光。LED的蓝光柔和背景与目标对比鲜明，不易产生视觉疲劳；使用LED不用担心汞蒸气对身体的伤害；无需提前打开光源预热，并且在读片的过程中显微镜没有热量产生。在对周围环境的要求上，LED没有光线及暗室的要求，在一个光线微弱的环境中就可以读片。鉴于LED显微镜操作简单，价格低廉，具有高敏感性和特异性，读片所用的时间及视野都较萋尼抗酸染色法有很大优势，WHO推荐LED荧光显微镜作为常规光学显微镜的代替。

尽管涂片镜检具有简便、快速、成本效益比高等特点，但是作为活动性肺结核诊断的“标准”，其敏感性和特异性的差异却很大，特别是无法区分死菌和活菌。另外传统抗酸染色对于细胞壁缺失型（L型）结核分枝杆菌的检查效果不理想，虽然曾改良染色法检查，如IK（intensified Kinyouns）抗酸染色、三联染色法（FFCT）、米塔尼尔黄改良法等，但因检出率仅为26%～37.4％，且特异性不稳定，导至实际应用受到影响。

基于形态学的检查除了用于肺结核的诊断外，显微镜观察药敏分析（microscopic observation drug susceptibility，MODS）也是一项低成本的药敏分析技术。该技术依据结核分枝杆菌在液体培养基中生长时形成索状结构，采用倒置显微镜观察索状结构可用于结核分枝杆菌的快速诊断，对比含有和不含有药物培养孔内的生长情况，即可得出“敏感”或“耐药”的结果。研究报道显示，MODS 对四种药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇) 的药敏试验结果，与现有分枝杆菌药敏实验检测系统得出的结果能很好地吻合。但是，有些结核分枝杆菌并不形成蜿蜒的索状微菌落，而且堪萨斯分支杆菌在营养培养基中也能形成类似的索纹结构，难以和结核杆菌区别开来。另外，在牛结核高流行国家，如何区分牛分枝杆菌和结核分枝杆菌，也是一个问题。此外，实施 MODS 和其它的培养鉴定新技术，主要的困难还在于生物安全性。痰液样本的消化、去污染与离心浓缩同时进行，而离心过程肯定会产生含菌气溶胶。另外，操作带菌的细胞培养板，也有潜在风险，必须在生物安全柜内进行。因而实施这种“便宜”的测试也必须在符合生物安全要求的实验室完成。

2. 分枝杆菌传统培养（或称固体培养）：由于分枝杆菌的生长繁殖对营养要求较高，多年来广泛使用的是罗氏鸡蛋培养基和Middlebrook 7H11琼脂培养基。结核分枝杆菌培养结果仍是目前诊断肺结核的金标准。尤其是分离培养结果与镜检方法结合，能够鉴定目标菌的活力程度，该特点在耐药性检测并指导临床用药等方面具有重要作用。但由于结核分枝杆菌的生物学特性，决定了传统的罗氏培养需要4~8周才能判定结核分枝杆菌是否生长，导至了检验结果无法满足临床诊疗活动实效性的矛盾。

为解决传统固体培养检查检验结果实效性的问题，2000年后出现了变色培养基测定法。此方法具有培养和药物敏感性检测的双重功能。其原理是在固体培养基中加入氧化还原显示剂无色四氮唑盐（Tetrazole），当有分枝杆菌生长时，分枝杆菌氧化还原系统将培养基中的无色四氮唑盐还原成不溶于水的紫红色物质，并以颗粒形式分泌至细胞表面，从而使结核分枝杆菌菌落变成肉眼可观察到的红色或紫色菌落。变色培养基法阳性结果报告时间平均为10天左右；与罗氏培养基比较阳性率提高约10%～15%，且操作简便，不需要昂贵大型仪器设备，适于在发展中国家和贫困地区推广应用。在实际应用过程中，变色培养法存在阳性率不高，结果判断易带主观性，且变色存留时间较短，仅2～3天紫色即消失，需及时观察结果等问题。

虽然培养法的敏感性、特异性高于抗酸染色镜检，但阳性率也只有30%~40%。同时，由于各种分枝杆菌均可生长，要确定培养阳性结果是否为结核菌，仍需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。

以生物表型特性培养为基础的分枝杆菌药物敏感性试验和菌种鉴定实验，对于结核病人合理的药物选择、合适的药物剂量以及针对耐药病人的预防控制具有积极的作用。特别是结核病耐药性监测可以为评估制定国家结核病控制规划和控制策略提供科学依据。

绝对浓度发药敏试验是60年代以来结核病实验室特别是医院的实验室用于结核分枝杆菌药敏试验的常用方法，其原理是接种同一浓度的菌液在两支不同浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，根据含药培养基上菌落生长的数量，确定测试菌株对该药的耐药性。比例法药敏试验是1996年世界卫生组织在我国开展耐药监测以来广泛在结核病实验室用于耐药性检测的方法。其原理是接种两种不同浓度的菌液在两支同一浓度的含药中性改良罗氏培养基上，计数对照培养基和含药培养基上细菌生长菌落的数量，计算耐药百分比，确定测试菌株对该药的耐药性。无论是比例法还是绝对浓度法，都需要1个月时间报告药敏结果。

分枝杆菌菌种鉴定需要经过一系列生物表型实验，如：对硝基苯甲酸（PNB）生长试验、28℃生长试验、细菌的生长速度、菌落形态和菌落颜色，以及耐热触酶试验、硝酸还原等分枝杆菌酶学实验，待测菌株菌体高效液相色谱-质谱组分分析（HPLC-MS）来确定该菌株属于结核分枝杆菌。

3. 分枝杆菌生长指示管（mycobacteria growth indicator tube，MGIT）系统：也被称为快速培养或液体培养。BD公司开发的MGIT-960系统、生物梅里埃公司BacT/ALERT 3D是第二代分枝杆菌快速培养、药敏检测系统。目前的检测系统解决了此前Bactec TB-460存在的放射性污染问题，并保留了其快速的优点，使结核病细菌学检查方法有了进一步发展。其基本原理是培养瓶底部含有包被于树脂上的荧光显示剂。由于该显示剂具有氧抑制性，当分枝杆菌生长消耗氧后，荧光显示剂被激活而发出荧光。通过检测系统定期连续测定培养管内荧光强度，判断管内分枝杆菌生长情况。该培养仪可用于痰、支气管灌洗液、胸水、腹水、脑脊液、尿液、脓液、关节液、病灶组织或干酪样块等各种临床标本的分枝杆菌培养、初步菌种鉴定和药物敏感试验。国内外应用结果表明，该系统用于分枝杆菌培养，在阳性率、阳性结果报告时间显著高于传统固体培养法，且自动化程度更高、操作更为简便。阳性标本检出时间平均为9天；结核分枝杆菌菌群鉴定、药敏试验时间平均为7天；阳性标本检出率比固体培养方法提高10.77%。

4.噬菌体裂解试验：检测原理是结核分枝杆菌特异性噬菌体可进入活的结核分枝杆菌使其感染，随后加入杀毒剂灭活未进入感染菌体内的噬菌体。进入菌体内的噬菌体在感染菌体内大量增殖，并裂解菌体，释放出的子代噬菌体可感染并裂解随后加入的指示细胞，从而在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无及其多少就可判断待检标本中是否存在活的结核分枝杆菌。由于噬菌体及敏感细胞均能快速增殖，本法从标本采集处理到结果判定只需18~24小时，并具有较高的敏感性和特异性，用于肺结核诊断，方法学的敏感度是75.0%，特异度为95.2%，阳性检出率为75.0%，该方法敏感性高、特异性强、操作简便，对结核病临床诊断有较高的应用价值。但其测定结果可受许多测定因素的影响，如噬菌体浓度、结核分枝杆菌活性、指示细胞的配置以及杀毒剂灭活时间等。

二、 分子生物学技术

近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从传统方法需要的几周降低到几天。目前已经投入临床使用的分枝杆菌基因诊断技术主要包括聚合酶链反应（PCR） 、核酸探针杂交、DNA序列测定、基因芯片、基因分型等。

1. 核酸扩增试验（nucleic acid amplification tests，NAATs）：一般称为PCR实验，主要是用于确定待测标本中有无结核分枝杆菌核酸。此类实验包括分子信标（Amplicor MTB）、链置换扩增技术（SDA）、连接酶链反应（LCR）等。这些技术基本都采用了实时定量PCR，对结核分枝杆菌核酸靶序列的确认都具有高特异性。但方法间敏感性差异较大，特别是对涂片抗酸染色阴性的标本。

2. 结核分枝杆菌耐药性快速检查方法

(1) 核酸线性探针检测（line-probe assay）：通过对阳性培养物或含结核分枝杆菌较多标本实施扩增—杂交反应来检测结核分枝杆菌耐药基因位点突变状态，诊断耐药性结核菌。其原理是应用生物素修饰的特异引物扩增DNA，使PCR产物带有生物素标志，将PCR产物变性后与固定在一张膜上的特异寡核苷酸探针杂交，通过酶免疫显色法显示结果。该方法简便，快速，可信度高，但是受膜上探针的限制，不能检测出所有的突变类型。如HAIN公司GenoType MTBDR可以检测一线抗痨药物利福平、异烟肼耐药；GenoType MTBDRsl可检测二线药物氟喹诺酮、乙胺丁醇、卡那霉素、阿米卡星、卷曲霉素的耐药。

(2) 环介导的等温扩增（LAMP）环介导的恒温扩增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）是用4条特异性引物分别识别目标DNA的6个特定区域，通过2个环状结构和链置换反应实现DNA的快速等温扩增。LAMP敏感性及特异性均较高，扩增快速、高效；其鉴别也很简便，只要用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度就能判断扩增与否。不足之处是反应结果只有两种：扩增与不扩增，如产生非特异性扩增，则不易鉴别。该方法对于涂片阳性标本的敏感性较高而对涂片阴性标本的灵敏度较低。

3. 多功能检测技术：2010年以后，多功能核酸检查进入临床应用。此类技术将快速分子检测整合在一个检测体系中。从而实现通过一次检测，实现判定待检标本中有无目标菌、目标菌鉴定、目标菌药物敏感性状态等多个检验目的。

(1) 基因芯片技术：始创于90年代初，又称DNA芯片，是分子生物学前沿的高新技术。其原理是在支持物（玻璃、硅片等）上将探针分子固定，然后与待检标本进行分子杂交，通过检测杂交信号强度从而得出样品分子的数量和序列信息。此方法可一次性对样品序列进行高通量检测和分析，具有自动化程度高，操作序列数量多，检测效率高等优点，可用于分枝杆菌菌种的鉴定、耐药性的监测、基因组比较分析等多方面检查。缺点是设备昂贵，检测费用高。

(2) Xpert MTB/RIF系统：Xpert MTB/RIF是美国Cepheid开发的全自动一体化荧光定量PCR仪，与之配套专用的结核分枝杆菌检测试剂盒，能在2小时内从患者新鲜痰液中直接检出是否含有结核分枝杆菌及该菌是否对利福平耐药。整个过程的手动时间不超过5分钟，而且它将样品的超声破碎、核酸提取、样品扩增、实时检测融于一体，都在一封闭系统中进行，对环境和操作者安全。检测敏感性和特异性高于现有检测方法。

(3) 2012年11月，Veredus实验室推出VereMTB多路复用分子诊断芯片。该芯片能够在三小时内诊断并鉴定结核分枝杆菌复合群（MTBC）和耐药基因突变体，以及其它九种与临床有关的非结核分枝杆菌。且检验过程只需自然样本。

4. 结核分枝杆菌DNA指纹图谱技术

相关技术主要用于结核分枝杆菌流行病学研究，利用结核分枝杆菌的生物标志（biomarker）来确定基因型（Genotype），从而分析不同表型特征的结核分枝杆菌在分布情况和流行变异趋势。

当前广泛应用的分型方法有： 限制性片段长度多态性分析（IS6110-RFLP）、随机扩增多态性DNA技术（RAPD）、数目可变的串联重复序列（VNTR）、分枝杆菌散在重复单位分型（MIRU）和单核苷酸多态性分析（SNPs）等技术。其中的IS6110-RFLP技术被认为是结核分枝杆菌基因分型的“金标准”，但是所需菌株量多，而结核分枝杆菌生长缓慢，并且低IS6110拷贝数的菌株则分析结果不可靠，因此该方法具有局限性。RAPD是继RFLP之后发展起来的检测基因组多态性的基因型分型方法，它是采用一系列随机引物对基因组DNA进行单引物扩增，简单、快速、模板要求不高和费用低廉，但是重复性较差。结核分枝杆菌基因组间随机重复序列一致性分析技术（MIRU-VNTR）是一种新的分型技术，和IS6110-RFLP相比，由于是建立在核酸扩增原理上的基因分型技术，因此具有检测时仅需少量DNA提取液，简单快速的特点，其实用性较高。

三、免疫学检查

结核病免疫学检查，目前仅能够用于是否感染结核分枝杆菌的诊断。限于传染性疾病的诊断标准和检查原理的限制，对于确定感染后是否发病，免疫学检查结果，无法替代病原学检查结果，仅能作为临床诊断的参考。但由于我国目前的结核病患者中，多数无法获得病原学诊断的直接证据，因此，结核病免疫学检查结果，仍然在结核病的诊疗活动中发挥“相当”的作用。

1、体液免疫检测技术：或称为抗原/抗体检查。从20世纪70年代建立了酶联免疫吸附法后，形成了很多以检测结核抗体或结核抗原为主的免疫血清学检测方法，在现代结核病的快速诊断中发挥着重要作用。

（1）酶联免疫吸附试验（ELISA）：该方法主要用于检测结核病人血清中的特异性抗体。然而结核病患者经常因免疫应答低下，导至体液免疫检测或细胞免疫检测假阴性。且由于种属间共同抗原决定簇的存在，导至结核抗原检测的特异性和敏感性低下，致使此法难以取得实质性的进展。

（2）结核分枝杆菌抗原检测：在结核病患者血清或标本中检出结核分枝杆菌抗原，可以作为病原菌存在的直接证据，也可以避免结核病患者因免疫应答低下导至的假阴性结果。近年来由于单克隆抗体制备技术的提高，可以制备高效价的特异性抗体，从而使得检测结核病患者血清中的结核杆菌抗原成为结核诊断的新方法。张周云等利用基因工程方法在体外表达结核分枝杆菌的desA蛋白抗原制备成单克隆抗体，利用该抗体采用ELISA双抗体夹心法检测了139 例临床已确诊的活动性肺结核患者血清中结核抗原，结果表明，其敏感性为84.17%，特异性为92.19%。

（3）斑点免疫金渗滤试验（DIGFA）：或称为金标法。该法比ELISA更为简便、快速，全程只需3~5min，并可单人份测定。由于操作简单，检测迅速，检出率高，不需要贵重仪器设备，能快速测定抗结核抗体，是一种较为理想的临床结核病辅助诊断方法，因此深受基层结核病诊疗单位欢迎。

（4）免疫印迹技术（Western blot）：或称为蛋白芯片检查。该技术是一类高特异性、高通量、高灵敏度且微型化的蛋白质分析技术，是蛋白组学研究近年来新兴起的一种方法。其原理是以微孔滤膜作为载体，将纯化的多种结核分枝杆菌抗原，利用微阵列技术固相于同一膜片上，并利用微孔滤膜的渗滤、浓缩凝集作用，在固相膜上快速进行抗原-抗体反应，最后在膜上以免疫金作为标记物直接显色。显色后将芯片放入芯片阅读仪，用专门软件对不同抗原点阵的灰度值进行分析，整个检测过程不超过30分钟。近年来，相关试剂盒用于检测痰菌阳性结核患者、痰菌阴性结核患者和肺外结核病的敏感性分别为93%、86%和89%，特异性超过95%。由于大幅度提高了诊断准确性，可做为结核病诊断，其参考价值得以大幅提高。但该法较上述几种测定方法繁琐且检测成本较高，临床常规检测应用相对较少，主要广泛用于科研实验。

2、结核病细胞免疫检查：细胞因子检测主要用于结核分枝杆菌感染确认诊断与机体免疫功能评价。

近年来，WHO推荐将γ-干扰素释放试验用于结核分枝杆菌感染诊断。Meta分析结果显示基于结核病特异性抗原刺激T淋巴细胞分泌γ-干扰素释放试验的QFT-IT（ESAT6、CFP10、TB7刺激）和T-Spot.TB（ESAT6、CFP10刺激）方法较结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test，TST）有较高的特异性和敏感性。由于目前报道的γ-干扰素释放试验用于诊断结核病的敏感性、特异性差异较大；结核分枝杆菌感染后的免疫反应与结核病的发生、发展和转归的关系尚未完全明了；人与人个体间免疫反应差异较大等诸多原因。导至至今所有的免疫学诊断方法包括γ-干扰素释放试验尚不能完全鉴别诊断潜伏性与活动性结核感染。

四、结语

由于结核分枝杆菌的特性、结核分枝杆菌感染发病过程的复杂性以及结核病流行程度的广泛性，决定了结核病实验室检查较其它传染性疾病的检验项目广泛，实验技术涉及的技术学科繁杂，检验结果的意义和目的，涵盖了临床诊断、治疗方案的确定和疗效评价、流行病学调查等多方面。因此，结核病实验室检查是目前医学诊疗和流行病学防控中较为独立的分支。

多年来，直到现在结核病诊断一直依靠全菌体为基础的病原微生物学的实验室检测结果作为唯一的确诊用的金标准，其主要原因是：

1、细菌核酸为靶标的分子生物学检测技术和机体免疫相关反应及其产物的检测技术出现较晚，尚不够成熟，人们更多的依赖于看到细菌的形态。

2、与病原微生物学检测结果可能会有少量不一致，造成诊断误差等问题。

笔者认为，作为一种细菌性传染病，病原微生物学检测技术是绝不会被淘汰的，但是由于结核分枝杆菌的生物学特性造成了结核病的病原微生物学诊断结果的敏感性、特异性较差；结果报告时间超长和相当一部分（细菌学检查阴性）病人得不到检测结果，造成诊断和治疗的困难或误差，同样会给病人带来伤害和痛苦。未来的结核病实验室诊断应在强调细菌学检验的标准化和规范化的同时加强研究、深入了解结核分枝杆菌的分子生物学特性及与宿主的相互关系；不断研究开发简便、快速、灵敏、特异的结核病实验室诊断新技术并进行大范围的验证，使之逐步完善，促进新的技术早日广泛进入实验室常规应用。