自身抗体实验室诊断意义与原则解读

检验医师

自身免疫性疾病是继心血管疾病和癌症后的第三类最为常见的疾病，其在人群中的发生率约为5%，并且还在呈上升趋势。

自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。每种自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗体谱。病人血液中存在高效价自身抗体是自身免疫病的特点之一，也是临床确诊自身免疫性疾病的重要标志之一。自身抗体检测在诊断自身免疫性疾病、判断疾病的活动程度、观察治疗效果、指导临床用药等方面具有重要的临床意义，具体分析如下：

一、自身免疫性疾病发生发展可能性的早期预测，并提示及早预防

近年来，回顾性流行病学研究极大地推动并加快了临床对自身抗体及早提示病情研究的进程。过去，如果从一个没有临床症状的病人体内检出自身抗体时，通常都会认为是一个假阳性结果。随着技术的进步，通过对储藏多年的血标本的研究表明，自身抗体可以先于自身免疫性疾病症状10到20年出现，有些病例可能出现的更早。

最明显的一个例子是原发性胆汁性肝硬化，其抗线粒体抗体（AMA）可以在症状出现前30年被检测到。抗双链DNA抗体（AntidsDNA）可以比系统性红斑狼疮（SLE）的症状早5到10年出现。其它一些研究显示糖尿病、Crohn’s病和溃疡性结肠炎也有类似的结果，即特有的自身抗体的出现会先于症状的出现。

能预测出一个看起来健康但最终会患上一种自身免疫性疾病的人会是一件很有意义的事。著名的自身免疫性疾病专家、特拉维夫（Tel Aviv）大学Yehuda Shoenfeld教授表示：我们正在进入一个新的诊断时期，那就是对疾病进程的预测将不再是一种猜想。我们第一次有可能对一种疾病做出明确的预后，并预测出疾病的个体特征、会受到影响的器官。所有目前已得到的结果都揭示出了早期进行广泛性筛查的意义和重要性。然而同时这一进展也要求对新的诊断技术的使用应该负有责任和符合伦理要求。那么什么样的人应当接受检测呢？无疑保险公司和雇主会对筛查结果很感兴趣，但是有无必要对整个人群进行检测或是仅仅检测高危人群、如自身免疫性疾病患者的亲属或已知的遗传性易患病体质？可以肯定的是对已经患有自身免疫性疾病的病人进行检测无疑会对其它相关疾病的诊断带来很大帮助。

就临床而言，早期诊断意味着可以进行有效的预防。对抗磷脂综合症的患者的早期诊断将有助于预防血栓栓塞的发生，同样对其它疾病来讲医生也能为患者以后的治疗提供更有价值的建议。如果不能阻止一种疾病的发生，那么早期诊断就表明我们可以在尽可能早的时间里对患者采取治疗措施。

二、通过监测抗体浓度变化来推断病情变化

某些自身抗体与疾病活动性密切相关，通过自身抗体效价与滴度的消长，可判断疾病的活动性，观察治疗反应，指导临床治疗。临床常见的疾病活动性相关自身抗体，最为典型的是系统性红斑狼疮中的抗ds-DNA抗体，其浓度变化与病情密切相关：患者病情活动、加剧时，该抗体阳性且抗体水平升高；病情缓解、稳定时，抗体水平降低甚至转阴。此类自身抗体检测实验室应强调定量、定期监测。

三、在分子水平上对自身免疫性疾病发病机制进行深层次探索

在不久的将来，除了分析自身抗体的诊断意义外，对其在自身免疫性疾病的发病机制中所扮演的角色的研究也将走在前面。通过追踪自身抗体的产生、变化，我们会了解到越来越多的自身免疫性疾病的病理机制。这类研究的结果将为预后判断、预防和开发新的治疗方法提供很有价值的线索。

自身抗体检测对于自身免疫性疾病的诊疗意义既非常明确，也非常重要，但要发挥自身抗体的诊断价值，正确的检测程序与适宜的检测方法是基本保障。

临床上，相当数量的实验室进行自身抗体检测时，常出现以下几种问题：

一、先进行总抗体的筛选实验，检测结果阳性再进一步检测靶抗原特异性自身抗体，完成确认实验

由于检测方法敏感性差异，此种检测程序可能会出现假阴性结果，例如，使用抗核抗体荧光法及抗线粒体抗体荧光法检测时，如果由于方法学问题漏检出现假阴性，即不对患者进行进一步检测，则容易导至漏诊误诊。

二、只进行自身抗体筛选实验而不检测靶抗原特异性自身抗体

较多的实验室认为只对患者检测ENA，ANA明确各个抗体的阴阳性即可，但是由于实验室不同方法学检测性能的差异，仅得出主观的阴阳性极容易导至误诊或漏诊，不利于直接进行疾病诊断；尤其是对于某些浓度中强阳才有确切诊断意义的自身抗体，仅仅阴阳性界定没有实质性的意义。

三、只检测靶抗原特异性自身抗体而不检测总抗体

只检测靶抗原固然可以保证单抗体检测的敏感性与特异性，对临床的指导意义也相对明确，但是一旦患者体内出现新的自身抗体，仅用已明确的自身抗原检测就会识别不出，就可能失去发现新抗体的机会，并造成患者的漏诊误诊。

四、只对自身抗体定性检测而不对其定量或半定量检测

对于与自身免疫性疾病活动性密切相关的自身抗体，如抗dsDNA抗体和抗中心粒细胞抗体等，只对其进行阴阳性判断或者用稀释比例来反映抗体变化，都会大大削弱其对临床医生的指导价值。

因此，应建立系统标准化的自身抗体实验室诊断流程来辅助临床提高自身抗体检测的正确率与诊断效率。

下面将对自身抗体实验室常用的几种方法学进行分析比较，为临床针对不同指标选择合适的方法学提供借鉴。

1、免疫荧光法 (Immunfluorescence Assay, IFA)

间接免疫荧光法（ indirect immunofluorescence, IIF）作为总的ANA筛选的经典试验，是采用核质丰富的培养细胞—Hep2细胞作为抗原，固定于载玻片上，与受检血清反应，形成抗原-抗体复合物，加入FITC标记的抗人IgG后，形成标记抗体-抗原-抗体复合物，在荧光显微镜下观察底物片上ANA荧光着染强度和免疫荧光图形。其优点是能够检测细胞核内已知和未知的自身抗体，如果抗原基质片质量保证，实验者经验丰富，硬件设备条件优良，其特异性非常高，是经典的确认试验；缺点是操作过程繁杂，容易受抗原切片问题、实验者主观经验、荧光显微镜分辨率影响，出现漏诊或误诊。

2. 酶联免疫吸附法 (Enzyme-linked Immunosorbant Assay,ELISA)

酶免疫测定是将抗原抗体反应的高度特异性和酶的高效催化作用相结合，发展建立的一种非放射性标记免疫分析方法。由于酶免疫试剂的性质比较稳定，操作方法简便快速、能高通量操作、无放射性污染以及应用范围广、成熟的纯化或重组抗原生产技术确保敏感性及特异性高、可量化且排除了人为的主观判断，费用低廉，是目前国外大多数自身免疫诊断检测实验室的首选检测方法。唯一的不足是单抗体检测成本可能会高于间接免疫荧光法。

3. 免疫印迹法 (Western-blot,WB)

免疫印迹技术（immunoblotting）属于膜载体酶免疫技术，其固相载体为吸附有抗原的硝酸纤维膜。其基本原理是将从小牛或兔胸腔提取的ENA抗原，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），按分子量大小分离成区带，每一区带根据分子量确定抗原成分，然后将各抗原区带转印至硝酸纤维膜上制成抗原吸附载体膜，实验时，不同区带位置对应不同抗原，可辩读出ENA中阳性抗体。优点是能一次检测多种抗体，方便、快捷、无污染；缺点是如果电泳分离不够成功，则造成检测结果的失误，并且有时仅靠颜色鉴别阴阳性，容易出现主观偏差。

4. 胶体金层析法(gold immumofiltraition assay GIFA)

胶体金免疫层析法即时检验技术（POCT）是20世纪九十年代以来在单克隆抗体技术、免疫层析技术及胶体金显色技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，是近年来生物产业化最成功的产品之一。

该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在NC膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体的区域时，待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留，聚集在检测带上，通过可目测的胶体金标记物得到直观的显色结果。而流离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离的目的。

胶体金免疫层析技术与ELISA技术原理不尽相同，前者技术要求更高，实施更为困难。其主要原因在于胶体金免疫层析技术发展快，时间较短；层析材料主要采用国外产品，国内产品尚无法达到要求。胶体金本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标的致癌性底物及终止液的步骤，对人体无毒害，金标记物比酶标记物更稳定，试验结果可以长期保存而不腿色。该法被认为是微生物和传染病及寄生虫病诊断技术标准化最有前途的新技术之一，并且可以进一步研发定量或半定量检测试纸条以及通用检测试纸条。

1995年3月，美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）发表了患者床边体外诊断（POCT）检验导则，即利用便携式设备和试剂在数分钟内得出检验结果的一种检验方式，广泛适用于医院、护理病房、救护单位、保险公司、家庭保健网络等领域，它的出现使传统上由专门检验人员完成的工作更多地交给了非检验人员完成，其快速得知结果，满足了人们在时间上的要求，适应现代社会发展的需要。

由于POCT不仅具有快速得出结果、操作简单、容易使用和小型化等特点，而且无需传统的医院实验场地和设备，这使得私人诊所或不具备条件的社会医疗机构也能快速正确地得到诊断，而自身抗体诊断的POCT化必然能极大地带动基层AID检测的普及与推广。

目前，类风湿关节炎最新诊断标准的出台，使得“抗CCP抗体”检测在基层医疗机构的普及变得非常急迫和必要，抗CCP抗体胶体金诊断试剂能很好地满足这一需求，值得在各基层医疗机构大力推广。此外，对于一些极具早期诊断意义的自身免疫性疾病，如PBC，如能有一种便捷的检测方法用于该病的流行病学筛查与危险因素调查，必然能加快对该病的研究，提高临床对该病的认知与重视，抗线粒体抗体Ⅱ型胶体金诊断试剂将能很好地解决这一问题。

我们也期待在加强基层医疗机构重要检测指标普及的同时，如能同步对临床医生进行自身免疫性疾病临床路径培训，必然能实现真正的AID早期诊断（首诊确诊）。

其他自身抗体实验方法还包括早期使用的放射免疫测定法与免疫双扩散法，目前临床使用较少，便不再赘述。

总的来说，随着医学的发展与进步，临床与实验室对自身免疫性疾病及其对应的自身抗体越来越关注，自身抗体在自身免疫性疾病早期诊断、提示预后、病情监测与发病机理探究中的作用也越来越凸显，此时，使用正确的检测程序与检测方法确保自身抗体检测结果的准确性并在此基础上节约经济成本与时间成本成为重要问题，本文对这些问题进行了简单地回答，供临床与实验室借鉴。

来源：定向点金