全自动H&E染色，助力肿瘤诊断病理学

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病理常规H&E染色和特殊染色是病理诊断工作的基础，是病理科诊断质量保证的基石。日前，在北京召开的罗氏诊断常规染色平台研讨会上，中国医学科学院肿瘤医院病理科主任吕宁教授担任会议主席，北京朝阳医院病理科主任金木兰教授等4位专家就常规病理工作中组织污染、制片过程中脱水环节问题、自动染色机的使用及特殊染色在肿瘤诊断中的应用进行了专题报告，为病理实验室自动化、规范化管理以及肿瘤的预防和诊治提供了新思路。

重视H&E染色过程中的污染问题

       来自西雅图Puget Sound Gastroenterology的病理学家、同时担任美国五所独立实验室病理总监的John B. Carpenter博士就病理实验室中的组织污染来源、处理措施等进行了系统分析。Carpenter博士认为，在制备H&E切片的过程中存在两大类组织污染：一是蜡块上的污染，可能是标本的处理、蜡块组织片的前处理及组织包埋等造成；二是切片上的污染，可能与技术员的操作区域、滩片的水浴或染色过程有关。

       会上，Carpenter博士强调了应加强对组织污染物的重视：“目前，滩片过程中水浴里的飘浮物被普遍被认为是切片中的组织飘浮物或污染物的主要来源，而切片在传统浸染式染液中进行处理时，因组织碎片从玻片中脱落常被众多病理工作者所忽视。这些污染物的存在，往往会对患者后续治疗方案的选择以及实验室的信誉造成影响。”

       Carpenter博士还分享了一项美国CAP组织的由275家病理实验室参与，对超过 378,000张切片进行的回顾性分析实验结果显示，切片中的组织污染情况远远超过一般病理学家意识到的水平，研究发现，至少在2.9%的切片上存在外源组织，其中15.9% 被诊断为异常组织，12.7% 为肿瘤组织，而73.0%的污染源并非来自蜡块本身，0.6% 被视为“严重”影响诊断结果。

       事实上，随着病理学的普及与逐步受到重视，一些病理工作者已就污染问题采取了一定的措施，如频繁清理或更换水浴中的染液等。然而，当前普遍实行的解决方案，包括加强仪器管理，试剂更换等，却面临实验室、试剂管理的高要求、浸染技术的局限性、花费时间长、以及增加实验室操作人员暴露在化学试剂中的几率等的挑战。目前，组织污染管理的关键是找到引入污染的来源，从根本上防止其发生。尽管通常情况下，病理医师能分辨出这些外源污染，不会影响诊断；但在某些临床诊断中，要求必须清楚分辨污染，如三种最可能出现诊断挑战的组织类型：食管和胃的活检标本、刮片标本、淋巴结和其他转移性恶性肿瘤的活检标本。

       Carpenter博士在会上指出：“在美国，尽管部份被怀疑受污染的病例可通过一些间接证据或分子生物学技术区分原有组织和污染物，但常因分子生物学检测技术的高昂费用及样本的限制而未能实施，病理学家及实验人员仍然需要花费大量精力对疑似污染物的来源进行排查。”Carpenter博士进一步分享了一些关于切片上的污染成因的分析研究，如著名的Jennifer Hurt教授就切片制作中最常见的污染源——滩片的水浴过程、浸染式染缸中两大污染进行的研究，以及Carpenter博士领导的一项71个中心参与的研究，均显示出不可忽视的污染比率，浸染式染色过程中染缸中的污染比率，尤其是脱蜡过程中的污染更应为病理工作者忧心。研究还显示，常规的换液操作未能达到减低污染的效果。这些都引起了在场的病理工作者就如何能真正有效的规范操作、改革传统的染色技术、单独滴染技术的使用等的讨论与深思。

全自动单独滴染技术实现了H&E染色的标准化、个性化及高效率

       临床上很多疾病都需要有病理诊断的帮助才能对症用药，而常规病理检测作为病理检测的基础，除了占用病理工作者的大部份工作精力外，如何在不影响准确性的前提下，提高工作效率，尽快完成尽量多的检测成为近年来病理实验室的发展趋势。会上，中国医学科学院肿瘤医院病理科技术组副组长郑波老师分享了该院使用Symphony全自动单独滴染H&E染色平台的经验；该平台采用全自动单独滴染染色技术，成为首台真正实现了全过程无人干预的全自动平台，郑波老师分享了如何利用该平台提高常规染色工作流程与效率的经验，并对比了原有开放式浸染式浸色仪与全自动单独滴染染色仪在质控与试剂维护过程中的差异，＂过去，原有的开放式浸染仪的质控操作，主要是通过定期更换试剂进行，染色质量与试剂中有效成份的浓度及氧化程度成正相关性，也与每缸溶液处理的切片数量相关；由于操作人员手工配制试液，使染色的质量随着操作员的更换及试剂重复使用的次数而出现变化，即使在注重质控与严格规定操作流程的实验室，由于实验室每天处理的样片数的变化且处理的组织不同，不同组织种类及大小对反应试液的影响程度亦不相同，在使用原有的开放式浸染系统时，仍然无法保证每天每张切片的染色效果保持一致。＂采用单张滴染式的染色技术，保证了每张切片均在默认的标准化程序化的条件下，使用新鲜试剂的进行染色，同时，即用型的试剂也减少了因不同技术人员在配制试液过程中，因称量、溶解、过滤等操作中可能引入的人为误差，提高了染色质量的稳定性。此外，从烤片、染片到封片集于一体的全程自动化，机内封片后即可交予病理医生阅片，加快了病理制片染色速度，减少了试剂维护时间花费，标准化了染色的操作流程，提高了组织病理实验室工作效率及穏定性，从而改善H&E染色全过程周转时间，提高工作时间利用率，简化质控、维护流程。独特单独滴染的设计确保每张切片使用新鲜试剂，使从根本上避免染式过程的组织交叉污染成为可能。

       随着亚专科建议及个体化治疗在病理界的推广，个性化、组织特异性的染色需求逐渐增多，会上，郑波老师也分享了中国医学科学院肿瘤医院病理科对制定可行性个体化染色方案的心得与境愿，过去，由于传统的浸染式染式技术的限制，所有切片必须按顺序进入的公用试剂中进行染色，同时使用不同的染色程序时, 可能出现前一组切片因特别定制染色流程而需延长在某一反应缸中的时间,使后一组切片不能按正常的时序进行反应缸进行反应, 从而延长了其在某些反应液中的滞留时间, 影响染色的效率与效果。为了保证恒定的产率与染色质量，往往只能使用统一的方案进行染色，单张滴染式的染色技术由于提供多模块可同时染色并采用每张切片直接滴加新鲜试剂单独进行染色的技术，平台内置的12种标准化的细胞核染色,7种标准化的细胞浆染色方案,共84种染色，,可同时执行25种染色方案, 使多方案同时实拖的境愿成为可能。郑波老师分享了科里依据不同的组织结构特点及医师个性化要求进行组织分类及特异性方案优化的前期经验，并和与会专家就如何进一步实施的个性化、组织特异性的染色方案的设想进行了积极的讨论。

       常规H&E染色制片的主要技术环节包括组织固定与取材、组织脱水、包埋、切片、烤片、染色、封片。一张好的组织切片需整个技术过程的全流程质量保证，而组织前处理即组织固定与脱水是整个过程的关键环节。宁波市临床病理诊断中心的技术总监王华老师详细介绍了组织脱水的基本原理、脱水过程的乙醇梯度设置、脱水不足造成的影响等。组织脱水不足或乙醇梯度设置不当可造成切片中组织结构的改变，如切片过程易出现组织震颤，细胞收缩、细胞间裂隙，细胞核收缩等；而脱水充分的切片染色细胞核轮廓清晰、饱满，染色均匀，组织结构清楚。会上，王华老师分享了影响组织脱水效果的主要因素对组织结构与切片质量的影响，与会相关专家们即就脱水过程中乙醇梯度设置、脱水时间、脱水剂更换时机、脱水机运行模式设置等相关话题进行了积极的讨论。

特殊染色在临床病理中的重要价值

       随着医学技术和肿瘤治疗的不断发展，个体化医疗时代已经来临。全自动化的病理检测技术，实现了检测流程的标准化和质量控制，加快了病理检测速度，在确保高品质检测结果的同时，可使临床医生获得更准确、可靠的检测结果，从而使个体化医疗发展成为可能。特别是在肿瘤的早期诊断、鉴别诊断、预后评估及指导靶向治疗药物用药中，病理检测技术均具有非常重要的作用。

       多种肿瘤的治疗、预后与血管浸润密切相关，特别是消化道癌、胃肠间质瘤、泌尿系统癌、肝癌、乳腺癌等H&E染色、免疫组织化学在判断静脉浸润时有局限性且假阴性率高。首都医科大学附属北京朝阳医院病理科金木兰教授介绍了特殊染色在肿瘤诊断中的应用，特别是弹力纤维染色和网状纤维染色的应用。特殊染色在恶性肿瘤的病理诊断中有不可或缺的作用，如判断胸膜、浆膜侵犯、血管浸润、早期微小浸润癌等。选择适当的特殊染色，可增加静脉浸润的发现率，提高胸膜、腹膜浸润诊断的准确率和早期微小浸润癌的诊断率，对判断预后、决定治疗方案有重大意义。弹力纤维染色使静脉浸润显示更为明显，有时还可帮助发现癌浸润浆膜，以辅助判断癌与原始浆膜表面的关系。此外，网状纤维染色能帮助清晰显示宫颈早期浸润癌的癌巢形态。

       会议进行得紧凑、有序，讨论热烈，使与会代表对常规病理制片过程及特殊染色问题有了更深入的认识。