化学发光免疫检测研究进展

青草 · 发表于 2014-8-8 22:31

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免疫学检测以其灵敏度高、操作简便、快速、易于标准化的特点在临床检验发展过程中占据了很重要的地位。临床免疫学检测先后经历了放射免疫（RIA）、酶联免疫（ELISA）和化学发光免疫（CLIA）三个阶段。近年来化学法光免疫分析以其灵敏度高、宽的线性动力学范围、光信号持续时间长、分析方法简便快速、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长等优点成为了检验界研究的焦点，本文对其研究进展进行了综述。

1. 免疫学检测发展阶段

免疫学检测主要是利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，由于其可以利用同位素、酶、化学发光物质等对检测信号进行放大和显示，因此常被用于检测蛋白质、激素等微量物质。我国免疫学的检测基本历经了以下几个过程，如图1所示。

图1 免疫学检测发展阶段

尽管免疫诊断在临床诊断中占据着非常重要的地位，但是从我国临床免疫诊断现状来看，无论是临床应用方面，还是产业化角度，都处于相对比较落后的状态，亟待改进。表１就此做一比较：

表1 中国免疫诊断现状

	中国	国际（欧美为主）
放射免疫法（ＲＩＡ）	•兴起于20世纪70年代，现仍普遍使用于县级以上医院； •产品处于衰退期； •厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。	•兴起于20世纪60年代，现已基本退出临床应用； •产品生命周期已终结； •厂商试剂和仪器共同开发，试剂基本系列化。
酶联免疫法（ＥＬＩＳＡ）	•兴起于20世纪80年代，现普遍使用于各级临床机构，为我国临床免疫诊断的基本方法； •产品处于成熟期； •厂商试剂与仪器共同开发，试剂尚未系列化。	•兴起于20世纪70年代，现仍在临床应用； •产品处于衰退期； •厂商试剂与仪器共同开发，试剂基本系列化。
化学发光免疫法（ＣＬＩＡ）	•导入于20世纪90年代，现个别较大医院开展个别项目； •产品处于导入期或成长期； •无厂商开发生产，完全依赖进口。	•兴起于20世纪80年代，现已被临床普遍使用，成为临床免疫诊断的支柱方法； •产品处于成熟期； •厂商试剂与仪器共同开发，仪器自动化程度高，试剂系列化状态好。

由以上分析不难看出，化学发光免疫检测是大势所趋；而取代进口，发展我国的化学发光检测事业，正是临床检验界着手发展的方向。

2. 化学发光免疫分析技术

2.1 概述

本世纪70 年代中期Arakawe首次报道用发光信号进行酶免疫分析，利用发光的化学反应分析超微量物质，特别是用于临床免疫分析中检验超微量活性物质。目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析（Chemiluminescent Immunoassay，CLIA）是将化学发光或生物发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新型标记免疫测定技术。其检测原理与放射免疫（RIA）和酶免疫（ELISA）相似，不同之处是以发光物质代替放射性核素或酶作为标记物，并藉助其自身的发光强度直接进行测定。

化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。

2.2 化学发光免疫分析原理

在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应系统和化学发光系统。免疫反应系统，其基本原理同酶联免疫技术（ELISA），常采用双抗体夹心法、竞争法、间接法等反应模式。化学发光系统的原理在于免疫反应中的酶作用于发光底物。发光底物在酶的作用下，底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。这种激发态中间体，当其回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比。由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。

2.3 化学发光免疫分析的应用

CLIA法常用的标记发光剂有鲁米诺、异鲁米诺及吖啶酯类。鲁米诺类的发光反应必须有催化剂如氯化高铁血红素等，致使本底较高，因而影响其灵敏度。80年代Patel等采用吖啶酯为发光剂，改进了标记方法。此法氧化反应不需催化剂，只要在碱性环境中就可进行，从而提高了测定的灵敏度。目前，CLIA法已得到临床实验室的广泛应用。在细菌学方面，建立了用鲁米诺标记抗体检测伤寒杆菌Vi抗原的方法，如Roekhill的SPA协同凝聚法和Barrettu的ELISA法检测Vi抗原，这些方法在灵敏度和特异性方面仍然理想，CLIA法测定Vi抗原的灵敏度为0.024ng/L，较文献中报道的ELISA法高41倍，检测范围为0.0061-400ng/ml，从特异性，灵敏度和检测范围看，Vi抗原的CLIA法检测很有希望成为早期快速诊断伤寒的一种新的免疫测定法。在炎症方面，蒋滋慧等人用鲁米诺标记抗体测C反应蛋白（CRP），CPR在正常人血清中含量甚低（1-3μg/m1）。以前传统的火箭电泳法和放射免疫法也能测到数值。但是采用CLIA法不仅具有RIA的灵敏度高及特异性强的优点，而且还无同位素污染和需要防护的缺点，且CLIA法与火箭电泳法及RIA法有显著相关性（r=0.94，r=0.96），因此CLIA法完全可以替代RIA法。由于吖啶酯标记抗体的发光免疫法简便易行，标记条件温和，不易损伤被标物质微量物质，所以它的应用范围比鲁米诺类更为广泛开展。如刘农乐等人采用吖啶酯类发光剂标记抗体测表皮生长因子，特异性及灵敏度均与RIA相似。施秉仪等人用吖啶酯发光剂标记抗体测载脂蛋白AI、AⅡ和B，除重复性不够满意需进一步提高外，它的优点很多，如灵敏度高、测样时间短（1-10s）、特异性强、标准曲线范围较广、标记抗体稳定性好、无毒性、固体载体珠和标记化合物廉易得等，因此可以期望这种新技术有可能在载脂蛋白测定中逐渐替代放免法。

2.4 全自动化学发光免疫分析——微粒子化学发光技术

传统的免疫分析技术，是采用特异性抗原吸附于聚苯乙烯固相载体中，然后与传统的发光标记物的抗原反应，去除反应后的混合物，并加以缓冲液冲洗，去除未结合的抗原及干扰物质，最后加入适当的氧化物激发发光来测定。其影响因素多、灵敏度、准确性均受影响。而微粒子化学发光技术，是采用最新磁性微粒，用以包被抗体，因其表面积增大，可迅速捕捉抗原，且所需标本量极少，孵育时间大大缩减，使测定迅速完成。同时因其选择性吸附抗原，减少污染，从而提高了特异性、灵敏性，使测定结果准确、可靠。

在90年代初，历经几代的化学发光技术由巴斯德研究院美国工业部产生的ACCESS微粒子化学发光全自动免疫分析系统的问世而得以真正应用。使之成为迄今最为完善的微粒子化学发光技术。目前能用于临床诊断的疾病有甲状腺疾病检测系统、贫血症检测系统、生殖性激素检验系统、糖尿病检测系统、药物浓度检测系统、心血管动力学检测系统、代谢类激素检测系统、传染性疾病检测系统、肿瘤因子检测系统等九大系统60多项测试项目。

3. 化学发光免疫分析技术展望

化学发光免疫分析技术以灵敏度高、宽的线性动力学范围、光信号持续时间长、分析方法简便快速、结果稳定、误差小、安全性好及使用期长等优点越来越得到检验界的重视，将向以下几个方面发展：

3.1 CLIA试剂盒：CLIA的技术优势已被大量实验研究结果所证实，随着开放型自动测量仪器的完善，必将为生物医学研究工作者提供开发和研制CLIA试剂盒的条件，从而打破国外大公司对试剂的垄断。根据现有的文献资料，试剂盒质量的进一步提高，可能在以下几方面研究：（1）磁性微粒子的应用：磁性微粒子在CLIA中的应用已取得成功，它是以共价键结合取代物理吸附制备固相抗体，具有表面积大、活性基团多、结合牢固、免疫反应结合快等优点。目前纳米磁性微粒子已有商品上市，国内尚在实验阶段。此项研究和应用将标记免疫分析提高到一个新的水平。（2）免疫反应增强剂的研究：早在20世纪80年代，已有文献提到在抗体抗原混合液中加入一种杂环结构的衍生物，可以加速抗原-抗体的免疫反应。这类试剂称之为免疫反应增强剂，其试剂名称和用量至今未见述及。很可能系生产厂家的自主专利。如此项研究取得成功，将缩短检测所需时间，为临床应用提供方便。（3）单克隆抗体在小分子化合物的应用：双位点夹心CLIA应用单克隆抗体检测大分子化合物具有高特异性、高灵敏度、高稳定性的特点。以单克隆抗体取代多克隆抗体，对标记免疫分析试剂的质量将有所提高。特别是采用双抗体夹心法检测肽类化合物其高度特异性是其他技术无可比拟的，无论是对基础医药学研究还是临床疾病诊断都具有重要意义。（4）新的发光剂的研究和应用：国外对发光剂的研究进行了许多系统实验观察，吖啶酯酶促发光应用得最多，前者为闪光，测量快速，主要适用于全自动CLIA系统；而后者以酶促催化底物发光，受温度、时间等因素影响，但发出的辉光对测量的要求不高，适用于开放型。在发光技术高速发展的今天，以闪光取代辉光是今后发展的方向。

3.2 全自动化系统仪器和试剂：CLIA全自动化分析系统均为国外产品，最近国内大型医院相继引进，型号各异。其简便快速，自动化程度以及相匹配的试剂盒质量基本上在同等水平，为大量临床样品检测提供了很大的方便。但目前所提供的试剂盒品种不多，仅可供常规项目的检测，且价格高，难以普及。未来发展除逐渐增多试剂盒品种外，仪器智能化程度也将有所提高。

3.3 其他领域研究：自动化发光测量仪器的研制近期已取得快速发展，因其价位低、开放型、不同规格的试剂盒都可检测，非常适合高等院校、科研单位和中小型医院普及CLIA。从现有的精密仪器制造水平来看，设计并开发出微型 CLIA自动操作仪和现有自动化测量相整合为一体，成为一种开放型微型自动发光检测系统成为可能。除广泛应用于生命科学研究、中小医院临床常规检验和防疫机构外，在农业、环保、地质、军事等领域也有很大的发展空间，特别是和其他技术如气相色谱、电子传感器等联合使用，大大扩大了化学发光技术的使用范围。